[发明专利]对多重核酸扩增中的光谱串扰的补偿

说明书

技术领域

本公开涉及核酸扩增技术，更具体地讲，涉及对利用荧光染料检测靶物种期间的光谱串扰进行补偿的技术。

背景技术

核酸扩增可用于测序、克隆、基因定位和其它形式的核酸序列扩增，或者用于通过构建包括已知浓度样品的结果的标准曲线来确定样品中的核酸初始浓度或其它形式的核酸序列扩增。核酸扩增可用于分析包括例如DNA和RNA在内的核酸。核酸扩增的类型包括聚合酶链反应(PCR)、转录介导扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

一般说来，PCR依赖于DNA复制酶在高温下保持稳定的能力。单个PCR循环包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。变性期间，在大约94℃下加热液态样品。在此过程期间，双DNA链“熔”开成单链DNA，且所有的酶促反应均停止。在退火期间，将单链DNA冷却到54℃。在此温度下，引物结合或“退火”至DNA链的末端。在延伸期间，将样品加热至75℃。在此温度下，核苷酸添加至引物，并最终形成DNA模板的互补拷贝。PCR分析通常多次(例如，约40次)重复此PCR循环，从而产生大量的复制DNA链。

当样品经历多个PCR询问周期(例如，循环)时，实时PCR可以用来检测存在于样品中的核酸的相对量。例如，样品可以包含当附着于双链DNA时发荧光的标记物。在这个例子中，检测器检测到的荧光与存在于样品中的双链DNA的数目成比例。因此，随着PCR的进行，荧光增加。

与转录相关的扩增实施例，例如基于核酸序列的扩增(NASBA)和转录介导扩增(TMA)使用基本上等温的条件和RNA聚合酶，以通过使用启动子-引物、引物、RNA聚合酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、核糖核苷三磷酸(rNTP)和启动子-模板互补寡核苷酸从核酸模板产生多个RNA转录物，或者可选地，还可包括其他寡核苷酸。分析可使用用于反应中的核酸的扩增的检测探针。在扩增反应期间，每一检测探针结合至其特定扩增子，并被转换成产生可检测信号的形式(例如，抗水解化学发光信号或比未转换形式更高的荧光强度)。

对通过核酸扩增工艺产生的数据的分析和精度仍存在需要。

发明内容

通常，本发明涉及在具有荧光检测装置的系统中，例如用于实时聚合酶链反应(PCR)扩增的系统中，提高通过核酸扩增产生的数据的分析精度的技术。具体地讲，所述技术可使可能由光学模块从一种染料检测的光谱信号的影响降至最低，所述光学模块被构造用于从不同的染料检测光谱信号，该现象在本文中称为“光谱串扰”，或简称为“串扰”。

在一个示例性实施例中，所述系统可包括针对四种不同的染料的光学检测提供四个“通道”的四个光学模块。能够检测多个靶物种的系统可称为多重系统。这四个光学模块均可被构造为在任何给定时间激发包含扩增核酸的样品的不同区，并从染料收集发射的不同波长的荧光能量。在包括多个光学模块的实施例中，可基本上同时地询问发生在样品内的多个平行反应。

每一光学模块可被优化为以分立的波长带检测相应荧光染料。换言之，光学模块可用于以不同的波长询问多个平行反应。所述平行反应可(例如)发生在转盘的单个处理室(例如，槽)内。另外，每一光学模块可为可移除的，以改变装置的检测能力。

所述多个光学模块可通过多分支光纤束光学耦合到单个检测器。这样，可利用多个光学模块和单个检测器(例如，光电倍增管)来实现复用。每一光学模块中的光学元件可被选择为使灵敏度最大化并使光谱串扰量(即，光学模块上来自一个染料的遗留信号，而该光学模块被构造为检测来自另一染料的光谱信号)最小化。荧光染料可在光谱上彼此间隔紧密，并可通过使用滤光器来区分以将从一个染料到另一染料的信号遗留最小化。由于典型荧光团的宽的吸收和发射谱带，滤光器可减少光谱串扰但无法将其消除。强扩增信号的光谱串扰常常将导致邻近通道上的生长，并且可能被不正确地解释为靶通道上的生长。这可能导致假阳性测定。本文所述技术使用根据校准程序确定的一组校正因子来自动移除干扰信号。

本文所述技术可适用于减少或消除核酸扩增中的光谱串扰。在示例性实施例中，文所述技术可适用于减少或消除实时多重核酸扩增中的光谱串扰。光谱串扰由于一个荧光探针(例如，染料)在邻近检测通道上的光谱重叠而产生，并可导致假阳性测定。根据本公开的技术，根据校准处理确定一组串扰校正因子。描述了这样一种算法，其采用这一组校正因子来自动减去邻近通道在所关注通道上的信号量。这可减少或消除假阳性测定。