[发明专利]利用稳定辅酶的酶的稳定化

说明书

本发明涉及通过在存在稳定化的辅酶的情况下保存酶来使酶稳定的方法。此外，本发明涉及利用稳定化的辅酶来稳定化的酶，以及其在用于检测被分析物的测试元件中的用途。

诊断测试元件是临床上相关的分析方法的重要的成分。在这一点上，重点在于被分析物的测量，例如，代谢物或底物，例如，其可以借助特异于所述被分析物的酶直接或间接地测定。在这种情况下，被分析物借助于酶-辅酶复合物被转化，随后被定量。这要求被测定的被分析物与适合的酶、辅酶和任选的介体接触，在此辅酶被物理化学地改变，例如，通过酶反应被氧化或还原。如果另外使用介体，它通常将在被分析物的转化期间释放的电子从还原型辅酶转移到光学指示物或电极的导电部件上，从而该过程可以例如被光度地或电化学地检测。校准提供了测量的值与要测定的被分析物浓度之间的直接关系。

当提供诊断测试元件时的重要的指标是它们的长期稳定性。现有技术已知的测试元件，例如在血糖的测定中使用的，一般对于水和热非常敏感，此时通常地，特别是辅酶和介体的功能受损。商业上可获得的试验元件的另一个问题是它们对环境光的敏感性，其中酶系统的光吸收可以引起对酶、辅酶和/或介体的损害。在某些形式的应用中，例如，由终端客户自己进行测试的情况下，由于测量系统的不正确的、被忽视的不完善保存，从而产生错误的结果，这是用户很难检测的，可能引起相应疾病的不正确的处置。

可以用于提高诊断测试元件的稳定性的已知的手段是使用稳定的酶，例如，使用来自嗜热生物的酶。此外，有可能通过化学修饰，例如交联，或通过诱变来稳定酶。此外，也可以添加酶稳定剂，例如，海藻糖、聚乙烯基吡咯烷酮和血清白蛋白，或者酶可以封装到聚合物网络中，例如，通过光聚合作用。

还已经进行了尝试来通过使用稳定的介体来改善诊断测试元件的稳定性。因而，通过使用具有尽可能低的氧化还原电势的介体，测试的特异性被提高，反应期间的干扰被消除。然而，酶/辅酶复合物的氧化还原电势形成了介体的氧化还原电势的下限。如果氧化还原电势低于这个界限，与介体的反应被减速或甚至停止。

做为选择，还可能使用不用介体的诊断测试元件，其中，直接地检测辅酶，例如，辅酶NADH。然而这种测量系统的缺点是，天然的辅酶例如NAD和NADP是不稳定的。

NAD和NADP是碱不稳定的分子，在文献中描述了它们的降解途径（N.J. Oppenheimer, The Pyridine Nucleotide Coenzyme, Academic Press New York, London 1982, editor J. Everese, B. Anderson, K. You, chapter 3, pages 56-65）。当NAD或NADP通过核糖和吡啶单位之间的糖基连键的裂解而降解时，主要形成ADP-核糖。相比之下，还原型NADH和NADPH是酸不稳定的：例如，差向异构作用是已知的降解途径。在两种情况下，NAD/NADP和NADH/NADPH的不稳定性是由于核糖单位和吡啶单位之间的糖基连键的不稳定性。然而，在不剧烈的条件下，例如，水性溶液中，辅酶NAD和NADP是由于环境水分已经完全水解的。这种不稳定性可能引起被分析物测量中的不准确。

例如，B.M. Anderson在The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982, editor J. Everese, B. Anderson, K. You，第4章中描述了多种NAD/NADP衍生物。然而，这些衍生物的大部分不被酶良好地接受。因而迄今为止用于诊断测试的仅有的衍生物是 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（乙酰基-NAD），其在1965年被首次描述（N.O. Kaplan, J. Biol. Chem.（1956）, 221, 823）。这种辅酶也显示了酶的不良接受性，以及氧化还原电势中的改变。

WO01/94370描述了具有修饰的吡啶基团的进一步NAD衍生物的用途。然而，烟酰胺基团的修饰一般对催化反应具有直接影响。大多数情况下这种影响是负面的。在另一种稳定化构想中，核糖单位被改变，以由此影响糖基连键的稳定性。这种过程不直接影响烟酰胺基团的催化反应。然而，一旦酶展现了对核糖单位的强的和特异性的结合，它可能具有间接影响。在这一点上，Kaufmann等人在WO98/33936和US 5,801,006中以及在WO01/49247中公开了许多硫代核糖-NAD衍生物。然而，迄今为止没有显示出烟酰胺核糖单位的修饰与酶反应中衍生物的活性之间的关系。