[发明专利]致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术快速检测致病性嗜水气单胞菌所用的试剂盒及检测方法。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromona hydrophila)是条件致病菌，广泛存在于水和土壤中，可引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类及哺乳动物类等多种动物的全身性败血症或局部感染，常导致动物大量死亡，亦可引起人的败血症，脑膜炎和肠炎腹泻。嗜水气单胞菌是我国养鱼史上危害鱼的种类最多，流行地区最广，流行季节最长，危害养鱼水域类别最多，造成的损失最严重的一种急性传染病病原。自90年代在全国大范围流行以来，许多水产养殖动物都可以被感染发病，如鲫、鳊、鲮、鲤、鲢、鳙、草鱼、香鱼、狼鲈、鳟鱼、尼罗非鱼、鲶鱼、鮰鱼、黄鳝、鳖、鳜鱼和蛙等。

嗜水气单胞菌有致病性菌株和非致病性菌株之分。目前已被证实的致病因子有外毒素、蛋白酶、S蛋白、菌毛、外膜蛋白及载铁体等。致病性嗜水气单胞菌引起的疾病不仅给水产养殖业带来严重的经济损失，还可通过水产动物和水产品感染人畜，导致人畜腹泻和食物中毒，影响人类健康。目前的致病性嗜水气单胞菌检测方法步骤繁多，包括将分离后的菌体进行菌落分析、氧化酶试验、AHM鉴别培养、吲哚试验、革兰氏染色、糖发酵试验，之后进一步进行致病性鉴别，包括脱脂奶平板和斑点酶联免疫等试验步骤。这些方法操作比较烦琐，对实验结果的数据处理需要对菌落形态，生化特性进行人为的比较，判定，其准确性往往因人而异，难以把握，且费时。

LAMP是一种新型的核酸等温扩增技术，该技术针对靶基因的6个区域设计6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性并缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，在等温条件下就能完成反应，且扩增产物用肉眼能观察，可用于病原微生物的现场快速检测。

因此，本发明采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术，通过检测嗜水气单胞菌的致病因子四型菌毛编码基因，来检测致病性嗜水气单胞菌，这在国内外尚无报道。该方法的建立为由致病性嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病诊断提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决目前致病性嗜水气单胞菌检测步骤繁多、操作烦琐、对检测的数据处理费时且准确性难以把握的问题，为此提供致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒和检测方法。本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案包括建立致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒及用该试剂盒检测致病性嗜水气单胞菌的方法。

本发明致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括细菌DNA提取试剂和LAMP反应试剂，所述LAMP反应试剂中含有用于检测致病性嗜水气单胞菌的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含引物AH.PV-FIP、引物AH.PV-BIP、引物AH.PV-F3、引物AH.PV-B3，其特殊之处是所述引物AH.PV-FIP、引物AH.PV-BIP、引物AH.PV-F3、引物AH.PV-B3分别为：

AH.PV-FIP：

GTTTCCCCCATCAGATCCGTGGTTTACGCCACCCAGTTTCTTG

AH.PV-BIP：

TCCGGCCTGTATACCTGTATCAGGTTAAACCAGGGTGTCATCGCT

AH.PV-F3：TGATGGCACGAGACATCCA

AH.PV-B3：TGCTTGATCCCCTTGCTACT

所述LAMP反应试剂包括以下组分：

(1)LAMP预反应液：20～25mM pH为8.2～9.0的Tris-HCl、6～10mM硫酸镁、10～12mM氯化钾、8～12mM硫酸按、0.1～0.2％Triton X-100(或是0.1～0.2％Tween 20)、1～1.6mM dNTP、0.6～1.0M甜菜碱、1.5～2.2uM所述引物AH.PV-FIP、1.5～2.2uM所述引物AH.PV-BIP、0.15～0.3uM所述引物AH.PV-F3、0.15～0.3uM所述引物AH.PV-B3；

(2)聚合酶：每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶；