[发明专利]致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括细菌DNA提取试剂和LAMP反应试剂，所述LAMP反应试剂中含有用于检测致病性嗜水气单胞菌的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含引物AH.PV-FIP、引物AH.PV-BIP、引物AH.PV-F3、引物AH.PV-B3，其特征是所述引物AH.PV-FIP、引物AH.PV-BIP、引物AH.PV-F3、引物AH.PV-B3分别为：

AH.PV-FIP：

GTTTCCCCCATCAGATCCGTGGTTTACGCCACCCAGTTTCTTG

AH.PV-BIP：

TCCGGCCTGTATACCTGTATCAGGTTAAACCAGGGTGTCATCGCT

AH.PV-F3：TGATGGCACGAGACATCCA

AH.PV-B3：TGCTTGATCCCCTTGCTACT

所述LAMP反应试剂包括以下组分：

(1)LAMP预反应液：20～25mM pH为8.2～9.0的Tris-HCl、6～10mM硫酸镁、10～12mM氯化钾、8～12mM硫酸按、0.1～0.2％Triton X-100(或是0.1～0.2％Tween 20)、1～1.6mM dNTP、0.6～1.0M甜菜碱、1.5～2.2uM所述引物AH.PV-FIP、1.5～2.2uM所述引物AH.PV-BIP、0.15～0.3uM所述引物AH.PV-F3、0.15～0.3uM所述引物AH.PV-B3；

(2)聚合酶：每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

(3)LAMP反应稳定液：由矿物油或液体石蜡油组成；

(4)LAMP反应显色液：含有10％SYBR Green工的荧光染料；

所述细菌DNA提取试剂包含以下组分：TE缓冲液，5-15mM Tris，0.5-1.5mM EDTA，pH 8.0；溶菌酶，浓度10-20mg/mL，pH8.0；蛋白酶K溶液，浓度10-20mg/mL，pH8.0；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠，浓度2-5mol/L；乙醇，浓度95％。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述LAMP预反应液还含有0.6～1.2uM引物AH.PV-LB和0.6～1.2uM引物AH.PV-LF，所述引物AH.PV-LB和引物AH.PV-LF分别为：

AH.PV-LF：GACCGGCTGCCAGAAGGAG

AH.PV-LB：GTGCGCTATGACAACGATGAA。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为致病性嗜水气单胞菌基因组DNA，所述的阴性对照试样为非致病性嗜水气单胞菌基因组DNA。

4.致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测方法，其特征是按以下步骤：

(1)DNA抽提：

挑取纯化的菌落若干加入到pH8.0的100μL TE缓冲液中振荡混匀，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚，pH8.0，强烈振荡，12000rpm离心5分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000rpm离心5分钟，弃上清，加入100μL TE溶液，得到待检基因组DNA溶液；

(2)致病性嗜水气单胞菌的LAMP扩增：

①.根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N，N＝样品数+2(其中1管为阳性对照，1管为阴性对照)；

②.吸取权利要求1所述LAMP预反应液的体积为N×23uL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入N u L Bst DNA聚合酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；

③.向设定的N个反应管中分别加入24u L②步所述混合液，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对照DNA各1uL；

④.然后在上述每个反应管中再分别加入30u L LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；

⑤.在61℃～67℃下恒温反应40～70分钟；

(3)显色检测：

取出LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入1uL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化。