[发明专利]贻贝酶解多肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种贻贝酶解多肽，本发明还涉及该贻贝酶解多肽的制备方法及其在抗前列腺癌上的应用。

背景技术

多肽在生物体内可作为神经递质、白细胞介素和细胞生长因子等活性物质，具有维持生物体生长发育、免疫调节和新陈代谢等活性功能。现有研究表明，来源于生物体的多肽具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗高血压等活性功能，尤其是抗肿瘤活性已受到各国研究人员的关注。目前，有关天然肽和合成肽的抗肿瘤活性已有大量报道，并有部分多肽作为抗肿瘤药物已应用于临床；食物蛋白来源的多肽对于其抗菌、抗氧化、抗高血压活性研究颇多，而对其抗肿瘤活性的相关报道较少。

海洋生物蛋白种类繁多，来源广泛，作为活性肽的一个重要来源，已受到越来越多的关注。贻贝作为海洋生物的一个重要组成部分，隶属于海洋软体动物门(Mollusca)双壳纲(Bivalvia)贻贝目(Mytiloida)，在我国北方称海红，江浙称为淡菜，富产于浙江嵊泗周围海域。贻贝富含粗蛋白、脂肪和碳水化合物，此外还含有钙、磷、铁、维生素等多种微量元素。已有研究表明，贻贝提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝、降血压、降血脂、提高免疫力等活性功能，可参考专利号为ZL200510110096.8的中国发明专利《厚壳贻贝的提取物、制造方法及其用途》(授权公告号：CN100467030C)，该专利公开了厚壳贻贝的提取物在流感上的应用。类似的还可以参考专利号为ZL200510024391.1的中国发明专利《一种可提高免疫力功能的厚壳贻贝提取物》(授权公告号为CN100486593C)；申请号为200910101136.0的中国发明专利申请公开《厚壳贻贝脂溶性提取物及其制备方法和用途》(公开号：CN101606951A)。但至今未见有关贻贝酶解产物对前列腺癌细胞作用的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种贻贝酶解多肽。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种贻贝酶解多肽的制备方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种贻贝酶解多肽的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种贻贝酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列：

Asp Leu Tyr。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种贻贝酶解多肽，其特征在于采用如下步骤制备：

①取贻贝肉，制成均浆，调节pH值9.5～10，料液比为1∶2～1∶3，添加碱性蛋白酶，加酶量为1500～2000U/g，酶解时间为6～8小时，酶解温度为45～50℃，灭酶后离心，取上层清液；

②将上述的清液经过超过滤，收集分子量3K以下的水解液，浓缩并冷冻干燥；

③DEAE-SepharoseFF离子柱交换柱色谱分离，将步骤②中的冷冻干燥后产物通过DEAE-SepharoseFF离子柱交换柱，0.1～1mol/LNaCL梯度洗脱，洗脱速度1～1.5mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥；

④采用Sephadex G-25凝胶柱色谱分离，将步骤③所得的具有最高抗肿瘤活性的冷冻干燥后产物过Sephadex G-25凝胶柱，流动相为蒸馏水，流速为1.5～2mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥并用MTT法进行抗肿瘤活性实验；

⑤高效液相色谱纯化，将步骤④中得到的具有最高抗肿瘤活性冷冻干燥后产后过反相高效液相柱，色谱柱为Zorbax SB C₁₈(250mm×9.4mm，5μm)；柱温为室温；流动相为乙腈和水，梯度洗脱：0～20min，乙腈浓从0％变化到95％，洗脱速度2.5～3.0mL/min，紫外检测波长280nm。

所述的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌上的应用。进一步，所述的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌DU-145细胞抑制增殖上的应用；所述的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌PC-3细胞抑制增殖上的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用最佳的蛋白酶和优选的工艺对贻贝进行酶解纯化，将所得的目标肽应用于抗前列腺癌细胞上产生了很强的细胞抑制增殖作用，为抗前列腺癌提供了一条可行性研究途径；整体工艺简单，投入较少，易于推广应用。

附图说明

图1为各种蛋白酶的酶解物对DU-145细胞增殖抑制率的柱状图。