[发明专利]系统性红斑狼疮全血基因组中甲基化标记物IL-2RG及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于系统性红斑狼疮早期诊断的全血基因组甲基化生物标记物IL-2RG及其应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，简称SLE)是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。作为一种典型的严重危害人类健康的自身免疫性疾病，其病因和发病机制非常复杂，医学界至今尚不十分清楚。目前，SLE的诊断主要依赖临床表现和实验室检查，临床表现包括如面颊部蝶形红斑等，实验室检查主要有狼疮带试验、抗核抗体谱等。但根据临床表现及实验室检查确诊时，患者往往已多器官系统受累。因此，如果能将SLE的诊断上升到基因水平，找到一种能用于临床的快速诊断工具，则能对该疾病的早期诊断和尽早干预起到重要作用。

DNA低甲基化在SLE发病中起重要作用，目前已经研究发现T细胞过度表达的淋巴细胞功能相关抗原一1、穿孔素、CD40L及CD70基因低甲基化与系统性红斑狼疮的发病机制密切相关，进而影响到染色质结构的重塑.调节基因的转录。然而CD 11a、穿孔素、CD70均过度表达于SLE患者的CD4+T细胞，调控序列均存在低甲基化，与经5一聚胞苷处理的T细胞基因低甲基化序列相同。它们的这种差异也主要只是存在于CD4+T细胞的基因组中，实验需要抽取40到60ml毫升静脉血液分离提取足够的CD4+T细胞，然后再提取DNA进行克隆测序。整个实验过程耗时废力，并且要抽取60ml外周静脉血液，患者的依从性往往较低。如果能在全血基因组中找到一个甲基化生物标记，将会大大缩短试验时间，简化试验流程，提高患者的依从性。发明人通过大量阅读相关文献，最后筛选出IKBKG，IL2RG，RB1，ZAP70，FOS3，SH2B3C等一系列与免疫有密切关联的基因。最后得出IL-2RG的平均甲基化水平，在正常人和狼疮患者之间表现有明显的差异，可以作为系统性红斑狼疮的早期诊断的甲基化生物标记。

发明人的研究表明：全血基因组DNA特定基因高甲基化在SLE的发病机制中起重要作用。这种高甲基化在IL2-RG中表现明显。全血基因组中IL2-RG特定CpG位点处于高甲基化状态，其甲基化改变及模式有望成为极具前途的SLE早期诊断标志。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于SLE早期诊断甲基化生物标记物IL-2RG及其扩增片段。

本发明进一步目的在于提供上述用于SLE早期诊断甲基化生物标记物IL-2RG及其扩增片段的应用方法，尤其指在制备SLE早期诊断试剂上的应用。

一种系统性红斑狼疮全血基因组中甲基化标记物IL-2RG的序列如SEQ ID NO：1(见Genebank)。

所述的系统性红斑狼疮全血基因组中甲基化标记物应用于制备诊断系统性红斑狼疮的试剂。

所述的标记物IL-2RG用于制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒。

一种系统性红斑狼疮全血基因组中甲基化标记物IL-2RG扩增片段的序列如SEQ IDNO：2。

所述的系统性红斑狼疮全血基因组中甲基化标记物IL-2RG扩增片段应用于制备诊断系统性红斑狼疮的试剂。

所述的标记物IL-2RG扩增片段用于制备诊断系统性红斑狼疮的试剂盒。

扩增所述的IL-2RG扩增片段的引物如下，

第一轮PCR的引物为：

SEQ ID NO：3：上游5’-TGGTTATTAGGATTTTTAGTTATTTAG-3’；

SEQ ID NO：4：下游5’-TATTCACAATAACCCCTTAAAAAAA-3’；

第二轮PCR引物为：

SEQ ID NO：5：上游5’-TAGATAATTTTTTGAGGTGTGTGTG-3’；

SEQ ID NO：6：下游5’-CAATCAACCTAACCCTACTAATACC-3’。

通过检测本发明的甲基化生物标记IL-2RG的甲基化水平，统计出有意义，差异较为明显的特定甲基化位点，作为SLE早期诊断的依据。

本发明检测待检样品中IL2RG甲基化水平的方法包括步骤：(1)取待检样品血，从中提取全血基因组DNA，对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理。用甲基化引物分别进行巢式PCR扩增，将PCR产物纯化回收。(2)PCR产物回收纯化后与p-GEM T载体连接，克隆至DH5a感受态细胞，对重组阳性克隆进行测序。(3)结果分析，序列上表现为CG的为甲基化位点，TG的则为非甲基化位点。然后计算得出平均甲基化水平。

所述针对IL2-RG进行巢式PCR时，第一轮PCR的引物为：