[发明专利]基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因鉴别检测试剂的制备方法，具体的说，涉及基于G₄DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法。该试剂不但能够快速鉴别检测猪瘟病毒，区分猪瘟强毒和疫苗毒，而且还适用于其它病原微生物核酸的鉴别检测，属于基因工程技术领域。

背景技术

核酸是决定遗传性质的关键物质，每一种生物都有自己特定的核酸序列，各种各样的生物性状最终都能在特定核酸序列中找到根源。因此，核酸分析技术在病原微生物的鉴定诊断，分型和耐药性检测，疾病诊断与预后，SNP检测等领域有着广泛的应用，并发挥着重要的作用。

这其中对核酸突变的检测正占据越来越重要的地位，因为在人类疾病中相当一部分是由于各种致病菌和病毒侵染所引起的，科学家发明了很多针对这些病原体的药物，用来治疗感染性疾病。在这些药物的广泛应用拯救了许多患者的生命的同时，细菌和病毒耐药性问题也相伴而生。由于细菌和病毒固有的选择和适应性，再加上抗感染药物的不恰当使用，造成当前细菌和病毒耐药性问题成为一个非常棘手的问题。这些细菌和病毒的耐药性很大部分是由于药物作用靶蛋白的编码基因发生突变所引起的，这些突变通常为单碱基突变，即可造成蛋白质中某个氨基酸的改变，进而药物分子不能与突变蛋白相互作用。比如，HIV是一种逆转录病毒，其复制过程突变率高，在抗病毒治疗过程中，很容易产生耐药性突变，目前抑制HIV逆转录酶、蛋白酶、整合酶和包膜蛋白的多种药物均发现有多种相应的耐药基因突变。

一个简便高效的单核苷酸鉴别检测体系在感染性疾病治疗过程中有重要价值。它能帮助医生及时了解病人体内耐药性菌株、毒株的情况，适时采取有针对性的治疗方案。另外人体基因组中包含大量的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)，其中一部分SNPs与很多疾病易感性相关，对这些位点的检测技术是实现个性化医疗的关键技术之一。单碱基突变的检测和SNPs的检测技术上是一致的，都是确定一段DNA序列中的某个特定位置碱基种类。

DNA酶(DNAzyme)逐渐受到人们重视（Rich, A.; Zhang, S. Timeline: Z-DNA: the long road to biological function, Nat. Rev. Genet.2003, 4, 566-572.）。它能够催化双氧水氧化2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2^'-azinobis(3-ethylbenzothiozoline)- 6-sulfonic acid, ABTS]等过氧化物酶显色底物，生成有颜色的物质，并且DNA过氧化物酶能够作为催化标签融入各种检测探针中，实现用肉眼检测目标物。DNA过氧化物酶是Dipankar Sen 课题组发现的，它是G-四链体DNA与高氯铁血红素(Hemin)形成的复合物。DNA过氧化物酶作为催化标签有着自己独特的优势，例如：DNA过氧化物酶可以在检测体系中由G-四链体与Hemin原位组装形成，不需要额外的制备纯化步骤；它是一种DNA序列，可在合成过程中直接加入核酸探针序列中，或者通过碱基对互补与探针相连，省去额外的标记步骤；DNA序列稳定，有活性的结构很容易在溶液中形成，这样在运输存储过程中不需要特殊的条件。

猪瘟（Classical Swine Fever, CSF）和口蹄疫一样，是猪的一种高度致死性接触性传染病。目前，全世界仍有50多个国家和地区存在CSF。世界动物卫生组织（OIE）2005年出版的《陆生动物卫生法典》中将CSF列为必须报告疫病之一。我国是CSF高发国家，也将CSF列为“一类动物疫病”。猪瘟的防控成为养猪业的重要一环。在我国主要采用对猪只进行猪瘟兔化弱毒株疫苗，即C株疫苗进行常规免疫来对猪瘟进行防控。由于C株疫苗也是一种病毒，那么在生产实践中存在如何区分猪只是感染了野毒还是接种了疫苗的问题，因此猪瘟野毒和C株之间的鉴别判断就显得十分重要。

常见的猪瘟鉴别检测方法主要包括：病毒的分离和生物学试验、免疫荧光技术、核酸测序、荧光定量PCR等，但这些方法在应用过程中普遍存在着明显的不足，诸如周期长，操作繁琐，特异性和敏感性差，不规范，不适用于大批量检测，这给猪瘟的鉴别检测带来了巨大困难。因此，如何快速、准确对猪瘟病毒进行鉴别检测是目前面临的主要难题之一。 

发明内容