[发明专利]基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法

权利要求书

1.基于G₄DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

A、目标基因的提取

选取经猪瘟病毒感染后的细胞，经-70℃冻融3次，每次10-30分钟后，取200μl加RNA裂解液1ml混匀，室温静置10-15分钟，加0.2ml氯仿，再室温静置3-5分钟，于4℃ 12000g/min离心10-15分钟，上清液转移到另一个离心管，加0.5ml异丙醇，室温沉淀10-20分钟，再于4℃ 12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75%乙醇于4℃ 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的水20μl得到目标基因RNA；

B、cDNA的制备

采用基因提取试剂盒取步骤A所得到的目标基因RNA 10μl，加入反向引物 W3（-）1μl（20μmol/L）和dNTPs  1μl（10μmol/L），65℃孵育5分钟，再迅速置冰上5分钟，然后加逆转录反应缓冲液4μl（5×buffer），RNA酶抑制剂1μl，DTT 2μl（0.1mol/L），MMLV逆转录酶1μl，于42℃反应50分钟、75℃反应10分钟，即得到cDNA；

C、不对称PCR的扩增

取步骤B制好的cDNA 5μl，加入到100μl的不对称PCR体系中进行反应，循环条件为：95℃预变性2分钟；94℃变性15 秒，53℃退火15秒，72℃延伸15秒，扩增50-100个循环；最后72℃延伸10分钟，得到PCR产物；

D、G₄DNA酶显色反应

分别取G₄DNA酶显色反应缓冲液20μl、上游探针Prob1L 2μl（20μmol/L）、下游探针Prob1R 2μl（20μmol/L），竞争性探针Prob1C 6μl（20μmol/L），加无菌双蒸水补足为91μl，加入至步骤C所得的含有100μl不对称PCR反应液的200μl PCR管中，95℃变性5 min；30℃ 退火3min，加入Hemin底物0.5μl （50mmmol/L），放置5min，再加入8μl（50 mmol/L）ATBS和0.5μl（1 mol/L）H₂O₂显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。

2.如权利要求1所述基于G₄DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤B所述反向引物W3（-）的序列是5^' GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3^'。

3.如权利要求1所述基于G₄DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤B所述逆转录反应缓冲液的组成为：250 mmol/L pH 8.3的Tris-HCl，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl₂。

4.如权利要求1所述基于G₄DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤C所述100μl不对称PCR体系的组成为：正向引物W3（+）2μl（0.4-4μmol/L）和反向引物W3（-）2μl（20μmol/L），PCR溶液10μl （10×buffer），MgCl₂ 溶液8μl（2.5mmol/L），dNTPs溶液2μl（10mmol/L），Taq DNA聚合酶2μl （2U）以及余量的无菌双蒸水。

5.如权利要求1或5所述基于G₄DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：所述不对称PCR体系中的正向引物W3（+）序列是：5^'-gcgcgggtaacccgggat-3^' ，反向引物W3（-）序列是：5^' - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3^'。

6.如权利要求1所述基于G₄DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤D所述G₄DNA酶显色反应缓冲液的组成包括：100 mmol/L 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸10μl，2 mol/L的氯化钠和0.2mol/L的氯化钾共10μl。