[发明专利]一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌穿梭载体pSHK4及制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌之间的穿梭载体及制备方法与应用，本发明的穿梭载体可用于对副猪嗜血杆菌进行遗传操作及对该病原的分子致病机理的探索。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种重要的猪的条件致病菌，常在菌株寄生于猪的上呼吸道，致病菌株能突破上呼吸道屏障，引起猪的关节炎、脑膜炎、多发性浆膜炎，称为格拉泽氏病。该病常常在健康水平较高和免疫反应水平低下的猪群中发生流行，目前其流行在国内外有逐年上升的趋势，给全球养猪业造成一定经济损失。因此，该病原受到国内外研究者越来越多的关注，基因组学、转录组学、蛋白质组学相继应用于副猪嗜血杆菌，众多的潜在毒力因子被筛选出来。但是，这些高通量的组学研究，并不能确切的揭示出该病原的致病机理；相反，大量的初筛信息提出了更多需要解答的疑问和等待证实的猜想。要解答这些疑问、证实这些猜想，传统的遗传操作工具是必不可少的。

传统的遗传操作工具，包括用于基因克隆的穿梭载体、用于基因突变的自杀性载体以及相应的转化方法等等。而目前，研究者们在副猪嗜血杆菌的研究领域没有太大的进展，究其原因，主要是遗传操作工具的缺乏，成为深入研究副猪嗜血杆菌的重要限制因素。作为遗传操作的基础——用于副猪嗜血杆菌的高效可行的转化方法仍未建立起来。而要对转化方法进行系统详细的研究，在大肠杆菌和副猪嗜血杆菌中均能复制的穿梭载体则是必备条件。当前可以获得的载体中，无论是常用的商业化的广宿主范围的穿梭载体，还是针对巴斯德菌科其他菌种，如胸膜肺炎放线杆菌、睡眠嗜血杆菌等构建的载体，应用到副猪嗜血杆菌中，效果均不理想。因此，构建出一套适用于副猪嗜血杆菌的遗传操作系统是当前这一领域的重要任务，而大肠杆菌和副猪嗜血杆菌之间穿梭载体的构建则是实现这一任务的前提和基础。穿梭载体包括两个要素：适合于两种宿主菌的筛选标记；能在两种宿主菌中稳定遗传的复制子。大肠杆菌中常用的抗性筛选标记有些在巴斯德菌科的成员中并不能发挥作用。有研究报道(Susan E.H.West，Mary J.M.Romero，Laura B.Regassa，et al.Construction of Actinobacilluspleuropneumoniae-Escherichia coli shuttle vectors：expression of antibiotic-resistance genes.Gene，1995(160)：81-86.)，在胸膜肺炎放线杆菌和溶血性巴氏杆菌中，来源于Tn3的氨苄抗性基因与来源于Tn9的氯霉素抗性基因不能在原有启动子的作用下表达产物。另有研究(HerbertM.A.，Hood D.W.，Moxon E.R.，et al.Haemophilus influenzae Protocols，2003：56.)分析了能在流感嗜血杆菌中表达的抗性表达盒，在载体工具中常用的Tn5来源的卡那霉素抗性基因，在流感嗜血杆菌中不能发挥功能，而来源于Tn903的卡那霉素抗性基因则可以表达。基于这些已有的研究结论，由于副猪嗜血杆菌与胸膜肺炎放线杆菌、溶血性巴氏杆菌及流感嗜血杆菌的亲缘关系较近，我们可以推测，来源于Tn903的卡那霉素抗性基因可能会在副猪嗜血杆菌中发挥作用，从而作为穿梭载体的筛选标记。就第二个要素而言，穿梭载体可直接利用广宿主范围复制子，能在两种或多种细菌中复制；或是将来源于两种细菌的复制子组合到一个质粒骨架中，使各自的复制子在各自的宿主菌中发挥效用。在常用的广宿主范围复制子不能应用到副猪嗜血杆菌情况下，后一种方法成为更简单且直接的构建策略。本发明的目的便是利用这一策略，从副猪嗜血杆菌中分离出内源性质粒，利用其复制起始位点，以及ColE1复制子和来源于Tn903的卡那霉素抗性表达盒，构建一种能在大肠杆菌与副猪嗜血杆菌中稳定遗传的穿梭载体。

发明内容

本发明的目的在于获得一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌的穿梭载体，该穿梭载体是综合了商业化克隆载体pBlueScript SK(+)的复制起始点及多克隆位点、副猪嗜血杆菌内源性质粒pYC93的复制起始点和来源于转座子Tn903的卡那霉素抗性基因表达盒kan构建的。本发明中穿梭载体pSHK4的构建将为副猪嗜血杆菌的遗传学操作带来便利。

申请人构建得到一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌的穿梭载体pSHK4，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

一种大肠杆菌和副猪嗜血杆菌的穿梭载体pSHK4，它是通过如下步骤获得的：