[发明专利]抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒

摘要

本发明涉及抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体及应用该抗体检测人流感嗜血杆菌的免疫层析试剂盒，抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体是分别识别人流感嗜血杆菌P6蛋白62‑75位以及115‑128位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的抗体，人流感嗜血杆菌P6蛋白在GenBank序列号是AGH02799.1；人流感嗜血杆菌P6蛋白62‑75位以及115‑128位的氨基酸序列分别为VLVEGNTDERGTPE及LGHDEAAYSKNRRA。本发明所提供的两种兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体具有特异性好、纯度高、效价高、制备成本低廉的特点。

主权项

1.一种基于抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒；所述抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体包括AbP6A及AbP6B，所述AbP6A及AbP6B的制备方法是：1)经结构生物学分析及相关实验研究后，选定人流感嗜血杆菌P6蛋白62‑75位的14个氨基酸及115‑128位的14氨基酸组成的短肽分别作为制备兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体的两个线性抗原表位，该两段氨基酸序列分别为VLVEGNTDERGTPE及LGHDEAAYSKNRRA，将此二序列分别命名为P6A及P6B，所述人流感嗜血杆菌P6蛋白在GenBank中的序列号是AGH02799.1；2)将步骤1)所述的氨基酸序列P6A的N端、P6B的N端分别添加一个半胱氨酸后，用多肽自动合成仪分别合成多肽并纯化，纯化后的两条多肽分别与载体蛋白KLH偶联，形成P6A‑KLH复合蛋白及P6B‑KLH复合蛋白；3)分别将步骤2)所合成的两种复合蛋白乳化，乳化后分别在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔7‑10天；4)第三次注射10‑12天后，分别收集、分离得到两种含有兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体的血清，ELISA分别检测血清中兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体的效价，所述的两种兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体的效价均在1：60000以上；5)将步骤2)合成并纯化的两条多肽分别与溴化氰活化的Sepharose4B偶联，形成两组多肽亲和层析柱；6)将步骤4)获得的两种含有兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体的血清分别对应的加入到步骤5)制备的两种亲和层析柱中，并在4℃孵育过夜后，洗脱抗体，得到两种兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体；经SDS‑PAGE鉴定其纯度均在97％以上，将这两种纯化的抗体分别命名为AbP6A及AbP6B；上述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：1)量子点标记抗体AbP6A溶液：向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1ml，混合溶液，37℃反应5min后，再加入0.34mg的制备得到的抗体AbP6A，避光反应2h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000‑NH2至终浓度为1％m/v，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；反应后的样品用超滤管离心，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex‑200上纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集1ml后停止收集；将纯化后的样品用超滤管以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min；获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4℃保存备用；至此制得量子点标记抗体AbP6A溶液；所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/L MES以及0.74g/L EDTA，所述MES缓冲液的pH7.4；所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、1g牛血清白蛋白BSA以及0.1gNaN₃，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；2)制备结合垫将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的量子点标记抗体AbP6A溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后，4℃密封保存备用，至此制得结合垫；3)制备样品垫取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm×2.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封保存；所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐温‑20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP‑10，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；4)制备检测层将硝酸纤维素膜剪成4cm×4cm大小；将制备得到的抗体AbP6B和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL；将稀释好的抗体AbP6B装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.7cm；将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，剪裁成4cm×4cm的规格，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以及0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；5)组装检测卡5.1)将底板裁剪成4cm×7.3cm大小，备用；5.2)将吸水滤纸裁剪成4cm×3cm大小，作为吸水垫，备用；5.3)将步骤5.1)制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4)所述的检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；5.4)将步骤5.2)准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有0.2cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平；再将步骤2)所描述的结合垫按0.3cm重叠于检测层的左边缘处，0.3cm粘于底板上；5.5)将步骤3)所描述的样品垫则按一边0.3cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4℃密封干燥避光保存；上述试剂盒是基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：1)胶体金标记抗体AbP6A1.1)制备30nm胶体金溶液：取一个硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超纯水，将1ml1％m/v HAuCl₄溶液加入250ml三角瓶中并与超纯水混匀，油浴加热并搅拌至沸腾；向250ml三角瓶中快速加入2ml1％m/v柠檬酸三钠水溶液，溶液继续沸腾10min，待250ml三角瓶中的溶液由蓝色转变为红色时停止加热，将250ml三角瓶中的溶液自然冷却至室温，然后向250ml三角瓶中加入超纯水补齐至100ml；1.2)胶体金标记抗体AbP6A：1.2.1)取一个硅化好的50ml三角瓶，加入10ml步骤1.1)所制备的胶体金溶液，向胶体金液中加入240ul0.2mol/L K₂CO₃调节pH至8.5；1.2.2)在电磁搅拌器搅拌下，将抗体AbP6A加入胶体金溶液中，至抗体终浓度为10ug/ml，加入抗体时逐滴加入，加完后继续搅拌45min～60min；1.2.3)反应完成加入2.5ml5％m/v牛血清白蛋白BSA至终浓度为1％m/v，搅拌15～30分钟，4℃保存备用；1.2.4)将标记好的抗体AbP6A取出后装入50ml离心管,2500g，4℃离心5分钟，得到下层沉淀及上层清液，弃掉下层沉淀，上层清液转移至另一只50ml离心管，12000g，4℃离心30分钟，得到下层沉淀及上层清液，弃掉上层清液，将下层沉淀用10ml胶体金缓冲液重悬沉淀，然后再12000g，4℃离心30分钟，再次得到下层沉淀及上层清液，将下层沉淀最后用3ml胶体金缓冲液重悬，4℃保存备用；所述胶体金缓冲液中各组分含量分别是：10mM Tris、1％m/v BSA、1％v/vTween‑20、5％m/v蔗糖以及3‰m/v聚乙烯吡咯烷酮，所述胶体金缓冲液的pH为10.5；2)制备结合垫将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的胶体金标记抗体AbP6A溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后，4℃密封保存备用，至此制得结合垫；3)制备样品垫取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少2h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm×1.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封保存；所述样品垫处理液的制备方式是称取0.242g Tris、1g牛血清白蛋白BSA、1ml吐温‑20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP‑10，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至11后用去离子水定容至100ml；4)制备检测层将硝酸纤维素膜剪成4cm×2cm大小；将制备得到的抗体AbP6B和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL；将稀释好的抗体AbP6B装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.5cm；将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥18h，剪裁成4cm×2cm的规格，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以及0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；5)组装检测卡5.1)将底板裁剪成4cm×6cm大小，备用；5.2)将吸水滤纸裁剪成4cm×2.5cm大小，作为吸水垫，备用；5.3)将步骤5.1)制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4)所述的检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；5.4)将步骤5.2)准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有0.2cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平；再将步骤2)所述的结合垫按0.2cm重叠于检测层的左边缘处，0.4cm粘于底板上；5.5)将步骤3)所述的样品垫则按一边0.2cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4℃密封干燥避光保存。