[发明专利]一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌穿梭载体pSHK4及制备方法与应用

权利要求书

1.一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌的穿梭载体pSHK4，其包含有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的一种大肠杆菌和副猪嗜血杆菌的穿梭载体pSHK4，它是通过如下步骤获得的：

1)以载体pBluescript II SK(+)为模板，进行两次PCR扩增，分别得到含有其多克隆位点的DNA片段MCS，其核苷酸序列如下所示：

CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAA；

2)以载体pBluescript II SK(+)为模板，进行PCR扩增，得到含有质粒复制起始点的DNA片段UC ori，其核苷酸序列如下所示：

GGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGA；

2)以质粒pLOF/TAG为模板，PCR扩增，得到质粒pLOF/TAG上miniTn10转座子中的卡那霉素抗性基因表达盒kan，其核苷酸序列如下所示：

CTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACA；

3)以保藏号为CCTCC NO：M 2010264的副猪嗜血杆菌菌株YC0093中的内源性质粒pYC93为模板，PCR扩增得到其最小复制区YC93 ori，其核苷酸序列如下所示：

GAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACACCTTTTCCAGCCTCGTTTGGAAAGTTTCATTGCCAGTAATACCAATGCTTTAGAAAGAAAAAGGGATCGAACTTTTGACATTCGATCCCTTTTTCTGTAATCTGTTTCGTGCGTTCTTTGCTAAGATACAGACCCTAGACAAGTCATATCTTAGCAAAGGGTAGCTAGTAATGCAAGAGATTGCGAAGCGTCCCTACTACCAAAAAACCATTCAACGACGTAAACAGACAAACGCAAACCTTAAATTAGACGGTCTTCAGCTCGGACTTCGGAAGAATAAACAGGCGTAGAAGTGATAACGTTCTTAATACGAAAATTAAGCTCTGTCTCCGTTTCGTGCTACGGTTAGAAAGGCGAAAGCCCCAAGAAATACAAGCACACCTGATAAGCGAGATTTAAGGATAACAGCGAAATTCAATAGGGTCTGAATTTCCAAACTAGGTTAAATGCCACGACGTTTTATTGTTGCCCCATTCAAGCAACATTTGAGAACCGAATAGAAATCTTTTAGTAAAAAGCGTTCTTTTTTGGGTCAGCGGTTAATGTGGACGGTTTAACGGTTTTTCCCCTGCGGGTCGTATTGGAAAGCCATTGAAAAGCTGATGGATAACTCTGCGAGTTACCCACGAGCTTTCCAACAGCTTTCCAACACTAAAAACCTACCGCCCACAATAACCACTTCCCTAATAATAAAATTTTTTTATTTTTATTTTGGTTCAAAGGCTCACGATGTTCGCCTAATAAAACGAAGTCGCCTATCGGCTCCGCTGATTTTTATATATCACTCTCGGGGCTTTTGGTGTACTATTGTCTTTTGTAATAGCAAGGACACAAAAAGGGTACTCTTCGAGTTTCCTTTTTGACCTTGCAAAAGGGCTTTGGGTACCGAG；

4)运用重叠PCR的方法，将以上三个步骤获得的四个DNA片段连接成一条DNA片段MUKO，其核苷酸序列如下所示：

CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACACCTTTTCCAGCCTCGTTTGGAAAGTTTCATTGCCAGTAATACCAATGCTTTAGAAAGAAAAAGGGATCGAACTTTTGACATTCGATCCCTTTTTCTGTAATCTGTTTCGTGCGTTCTTTGCTAAGATACAGACCCTAGACAAGTCATATCTTAGCAAAGGGTAGCTAGTAATGCAAGAGATTGCGAAGCGTCCCTACTACCAAAAAACCATTCAACGACGTAAACAGACAAACGCAAACCTTAAATTAGACGGTCTTCAGCTCGGACTTCGGAAGAATAAACAGGCGTAGAAGTGATAACGTTCTTAATACGAAAATTAAGCTCTGTCTCCGTTTCGTGCTACGGTTAGAAAGGCGAAAGCCCCAAGAAATACAAGCACACCTGATAAGCGAGATTTAAGGATAACAGCGAAATTCAATAGGGTCTGAATTTCCAAACTAGGTTAAATGCCACGACGTTTTATTGTTGCCCCATTCAAGCAACATTTGAGAACCGAATAGAAATCTTTTAGTAAAAAGCGTTCTTTTTTGGGTCAGCGGTTAATGTGGACGGTTTAACGGTTTTTCCCCTGCGGGTCGTATTGGAAAGCCATTGAAAAGCTGATGGATAACTCTGCGAGTTACCCACGAGCTTTCCAACAGCTTTCCAACACTAAAAACCTACCGCCCACAATAACCACTTCCCTAATAATAAAATTTTTTTATTTTTATTTTGGTTCAAAGGCTCACGATGTTCGCCTAATAAAACGAAGTCGCCTATCGGCTCCGCTGATTTTTATATATCACTCTCGGGGCTTTTGGTGTACTATTGTCTTTTGTAATAGCAAGGACACAAAAAGGGTACTCTTCGAGTTTCCTTTTTGACCTTGCAAAAGGGCTTTGGGTACCGAG；

5)用限制性内切酶KpnI消化DNA片段MUKO，再使DNA片段MUKO自连环化；

6)将步骤5)得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，得到穿梭载体pSHK4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1所述的穿梭载体pSHK4在细菌遗传操作中的应用。