[发明专利]流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于设有盒体、裂解液、吸附液、洗涤液、PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

2.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述裂解液的配方为：5mol/L盐酸胍，0.1mol/LEDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0。

3.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述吸附液的组成为玻璃粉、浓硝酸与水，所述玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g∶(5～6)mL∶(10～12)mL，其中玻璃粉以质量计算，浓硝酸和水以体积计算，所述浓硝酸的质量分数可为55％～70％。

4.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述洗涤液的组成为：0.1mol/L氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇。

5.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应液的配方为：每23μL中包含10×PCR缓冲液2.5μL，正向引物P1 0.5μL，反向引物P20.5μL，dNTP 2μL，Taq酶0.25μL，双蒸水17.75μL；所述正向引物P1和反向引物P2的序列为：

正向引物P1：5’-CAGCTGGGAGACAACGGCACA-3’；

反向引物P2：5’-ACGAATTCGAGCTCGGTACC-3’。

6.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有pMD18-T-EHNV-MCP质粒的溶液；所述阴性对照为无菌水。

7.流行性造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选取待测样品，加入裂解液进行裂解；第1次离心，收集上清，加吸附液，混匀，静置后，第2次离心，收集沉淀物，用洗涤液洗涤沉淀物后，再第3次离心，再收集沉淀物，加水充分悬浮沉淀物，即得PCR模板；

2)将步骤1)所得PCR模板加入PCR反应液中进行PCR反应，设立阳性对照和阴性对照，PCR反应的程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min；

3)PCR反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察，阳性对照应有一条195bp条带，阴性对照在195bp条带平行位置应无条带；若样品在该平行位置有195bp条带，则表明该样品含有病毒，若无195bp条带，则无病毒。

8.如权利要求7所述的流行性造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述第1次离心为12000rpm，第1次离心时间为3min；所述静置的时间为5min，静置期间摇匀1～3次。

9.如权利要求7所述的流行性造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述第2次离心为10000rpm，第2次离心的时间为15s。

10.如权利要求7所述的流行性造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述第3次离心为10000rpm，第3次离心的时间为30s。