[发明专利]一种筛选抗HSV-1药物的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种筛选抗HSV-1药物的试剂盒和方法。

背景技术

单纯疱疹病毒I型(HSV-1)为有包膜的DNA病毒，是危害人类健康的常见病原体，且容易导致复发性感染和潜伏感染。HSV-1感染部位广泛，能引起口唇疱疹、生殖器疱疹、脑炎、角膜炎等，并与宫颈癌和唇癌有关。HSV-1具有神经毒性，可侵犯中枢神经系统、破坏神经细胞。目前，治疗由HSV-1引起的上述疾病的有效药物主要为阿昔洛韦(ACV)，其吸收差，且根据国家药品不良反应监测中心病例报告显示，其引起的急性肾功能损害和血尿问题突出。因此，筛选更多抑制该病毒的药物非常必要。

现有技术中公知的主要筛药体系仍为传统的动物模型筛药体系和细胞模型筛药体系，存在实验周期较长，实验步骤较复杂等缺点，难以迅速将潜在药物筛选出来，不能满足药物研发初期高通量快速筛选药物的要求。

碱性核酸酶是由HSV-1基因组中UL12基因编码的，已经被报道有5’～3’的核酸外切酶和核酸内切酶活性，因其反应的最适pH值较高，所以被认为是碱性核酸酶。在HSV-1的复制中起着重要的作用，有研究证实碱性核酸酶能正确修复DNA复制过程中的断裂和缺口，并能使处于复制状态的病毒基因组易于包装。该编码基因被敲除后HSV-1突变体复制几乎停止，说明碱性核酸酶为病毒体内繁殖所必须。还有实验证明，在非容纳细胞中产生的UL12基因组缺陷病毒，由于有异常基因组而很难感染新的细胞。上述研究证明碱性核酸酶在病毒的复制及其感染过程中是非常关键的，这为碱性核酸酶成为一种新的抗疱疹病毒药物筛选靶点提供了证据。

也就是说，能够抑制碱性核酸酶活性的物质也具有抑制HSV-1的作用，进而推测这些物质具有治疗由HSV-1引起的各种疾病的作用。因此，筛选治疗这些疾病的潜在药物可以通过检测其能否抑制碱性核酸酶活性来实现。

然而，UL12基因片段长，GC含量高，难以通过常规的PCR方法方便、准确地获得全序列的UL12基因片段，进而获得大量有活性的碱性核酸酶，目前也未见市售品出现，因此以碱性核酸酶作为筛药体系关键成分制备快速筛药系统难以适应临床大量应用的需要。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺点，本发明提供了一种方便快捷地筛选大量抗HSV-1药物的方法。

因此，本发明目的之一是提供一种用于筛选抗HSV-1药物的试剂盒，包含HSV-1碱性核酸酶、碱性缓冲液、MgCl₂和核酸。

上述试剂盒内各成分浓度优选如下：HSV-1碱性核酸酶浓度为0.5～0.7mg/ml、碱性缓冲液浓度为40～60mM、MgCl₂浓度为2～4mM、核酸浓度为1.4～1.6μg/ml。

上述试剂盒内各成分浓度进一步优选如下：HSV-1碱性核酸酶浓度为0.64mg/ml、碱性缓冲液浓度为50mM、MgCl₂浓度为3mM和核酸浓度为1.516μg/ml。

为了克服现有技术难以方便获得大量有活性的碱性核酸酶的缺陷，本发明试剂盒中HSV-1碱性核酸酶是用如下方法得到的：其步骤如下：

(1)扩增目的基因：提取HSV-1病毒基因组作为模板，以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-1的UL12基因片段，扩增程序为：96℃预变性3min，95℃变性40s，68℃～72℃退火延伸2min30s，31个循环，72℃延伸10min；胶回收并纯化扩增的UL12基因片段；

(2)构建重组质粒：用内切酶将步骤(1)获得的UL12基因片段与表达质粒连接，获得重组质粒；

(3)诱导表达：将步骤(2)获得的重组质粒转化至大肠杆菌，涂布在含有适当抗生素的平板上；培养重组质粒的大肠杆菌转化子使其生长至对数期；加入异丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达；离心收集菌体；

(4)变性：a，用含有变性剂的洗涤液两次洗涤步骤(3)得到的菌体；b，冷冻超声破碎细胞，离心收集沉淀；c，用含有不同变性剂的多种洗涤液分别洗涤沉淀，离心，收集沉淀；d，用含有高浓度变性剂的洗涤液超声洗涤沉淀，得到蛋白溶液；

(5)复性：用盐酸胍浓度逐步减小的复性液复性步骤(4)得到的蛋白溶液，获得活性蛋白。