[发明专利]一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌及其耐高温壳聚糖酶的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐高温壳聚糖酶酵母基因工程菌的构建及其生产耐高温壳聚糖酶的方法。属于微生物基因工程领域。 

背景技术

壳聚糖酶(Chitosanase，EC.3.2.1.132)是降解壳聚糖的专一性酶，广泛存在于多种微生物中，目前在细菌(Bacillus、Enterobacter、Myxobacter)、放线菌(Streptomyces、Nocardioides)、真菌(Penicillium、AspergiUus、Rhizopus、Basidiomyce)、病毒(Chlorella virus PBCV-1、CVK-2)及植物的组织中均发现壳聚糖酶，但主要存在于细菌和真菌中。 

近年来国内关于壳聚糖酶的研究主要集中在菌株的筛选、菌株发酵条件的优化以及酶学性质和分离纯化等方面。在现有的商品化壳聚糖酶中，由于原始的菌株产酶能力低，纯化率和得率都不高，所以导致成品酶的产量有限且售价高。要实现工业化大规模生产高酶活的壳聚糖酶，除了筛选高酶活的菌株外，还可通过分子生物学手段对现有的壳聚糖酶基因进行诱变改造，实现其高水平的表达。 

现在商品化的壳聚糖酶在热稳定性等方面仍不足以适应工业化的要求，例如在许多工业应用中，常是在高温条件下使用壳聚糖酶，这就对壳聚糖酶的热稳定性提出较高的要求，但很多壳聚糖酶在温度超过40℃时，酶活降低很快。因此，迫切需要研制出一种廉价、高效、耐高温的壳聚糖酶来解决工业的发展需求和现有的壳聚糖酶热稳定性之间的矛盾。 

发明内容

本发明的目的是提出一种运用基因工程手段寻找偏爱密码改变的耐高温壳聚糖酶基因，使其适合在毕赤酵母中高效稳定的表达，及制备该耐高温壳聚糖酶的方法。 

一、耐高温壳聚糖酶基因的合成 

GenBank^TM accession number AY190324所示的壳聚糖酶的氨基酸序列中，存在一个N糖基化位点，和多个氧糖基化位点。毕赤酵母作为真核表达系统，具有糖基化翻译后修饰功能，可使蛋白质的热稳定性得到提高。在氨基酸序列的不改变的前据下， 对原始壳聚糖酶的核苷酸序利用DNAWORKS工具进行了优化，优化后的基因全部由毕赤酵母偏爱密码组成。优化后的核酸序列hbcsn与原始csn序列(GenBank^TM accession number AY190324)相比，有147个核苷酸发生了变化，核苷酸的同源性为77％，同时为了使壳聚糖酶在毕赤酵母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的壳聚糖酶基因少了编码5’端信号肽序列的17个氨基酸。然后根据优化后的序列设计引物，利用套叠PCR的方法合成该基因。设计的引物长度为48-55bp，相邻两引物之间有20bp左右的重叠序列，Tm值为58-62℃，所有的引物均在invitrogen公司合成。将所有的引物加入反应体系中，进行PCR扩增。PCR扩增的条件为：98℃ 30s，58℃ 30s 72℃ 1min，共25个循环，最后72℃ 7min。 

优化后的壳聚糖酶基因序列hbcsn与原始csn基因序列比较如下：(竖线表示上下对应的碱基相同，空格表示对应的碱基不同)： 

二、含有耐高温壳聚糖酶基因表达载体的构建。 

首先是将基因hbcsn用T4 DNA Polymerase处理，然后定向插入到毕赤酵母表达载体pHBM905A中。测序正确的重组载体命名为pHBMHBCSN。 

三、表达耐高温壳聚糖酶的毕赤酵母工程菌的筛选。 

将获得的重组质粒pHBMHBCSN经SalI线性化后，电击导入毕赤酵母Gs115中，重组子接种在含有壳聚糖为唯一碳源的平板上，从中筛选出水解圈最大的菌株，该菌株于2010年8月19号保藏于中国典型培养物保藏中心，名称为巴斯德毕赤酵母工程菌Gs115/HBCSN，保藏号：CCTCC NO：M 2010206，以下简称HBCSN。 

HBCSN菌株的菌学特性： 

A、形态特征：毕赤酵母属菌种细胞呈球形、椭圆形、拉长形，偶尔呈锥形，但不形成尖顶。菌落颜色为乳白色或奶油色。无性繁殖方式为多边芽殖。 

B、生理生化特征：毕赤酵母能利用甲醇，石油，铵盐等特殊物质生长，最适生长温度为28℃-30℃。HBCSN除了具有毕赤酵母的生理生化外，其染色体上整合有壳聚糖酶基因，能够高效分泌表达耐高温的壳聚糖酶。 

四.耐高温壳聚糖酶的制备方法。 

具体方法如下：