[发明专利]一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌及其耐高温壳聚糖酶的生产方法

权利要求书

1.一种耐高温壳聚糖酶的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如下：

tacaacctac ccaacaattt gaagcaaatt tacgataagc ataagggtaa atgttctaag  60

gtccttgcta agggattcac taacggtgat gcttctcaag gtaagtcttt ttcttactgt 120

ggagatattc ctggtgctat tttcatttct tcttcaaaag gttacacaaa catggatatt 180

gattgtgatg gagctaacaa ctcagctggt aagtgcgcta acgatccatc tggtcaaggt 240

gaaactgctt ttaagtctga tgttaagaag tttggtattt ctgacttgga tgctaatatt 300

catccatacg ttgtttttgg taacgaagat cattctccaa agtttaagcc acaatctcat 360

ggtatgcaac cattgtctgt tatggctgta gtttgtaacg gtcaattaca ttacggaatt 420

tggggtgata ctaatggtgg tgtttctact ggtgaggcat caatttcctt ggctgatttg 480

tgttttccaa acgaacactt agatggtaac catggacatg atcctaacga cgttttgttt 540

attggtttca cttcaaagga tgctgttcca ggtgctactg ccaagtggaa ggctaagaac 600

gctaaggaat tcgaagattc tataaagtct attggtgaca agttggttgc tggtttgaag 660

gcttaa                                                            666。

2.一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌Gs 115/HBCSN，简称为HBCSN，其保藏号为：CCTCC No：M 2010206。

3.一种耐高温壳聚糖酶的生产方法，其特征在于摇瓶生产步骤为：

将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基中，在28℃-30℃培养46-48小时，离心，再把菌体转入到BMMY中，进行诱导表达，每24小时向培养基中加入100％甲醇至甲醇的终浓度为1％，诱导六天，离心发酵液，上清液即为含有耐高温壳聚糖酶的粗酶液。

4.一种耐高温壳聚糖酶的生产方法，其特征在于发酵罐生产步骤为：

1)、种子培养基的制备为：将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基中，在28℃-30℃培养46-48小时；

2)、接种：按5％(种子培养基的体积/发酵罐中初始培养基的体积)的比例把种子培养基接入发酵罐中，发酵罐中的初始培养基为BMGY；

3)、第一阶段为菌体生长阶段，发酵参数为：温度28℃，pH5.8，通风量为0.5vvm， 搅拌速度250-700转/分，溶氧量30％，自接种开始10-14小时后，发酵罐中的甘油被消耗尽，此时流加50％甘油(W/V)混合物，当菌体密度OD₆₀₀＝300-320时停加甘油混合物，准备转入第二阶段，50％甘油(W/V)混合物成分为：每升50％甘油混合物中含有12mLPTM1微量元素混合物；PTM1微量元素混合物组分为：五水硫酸铜6.0，碘化钠0.08，一水硫酸锰3.0，二水钼酸钠0.2，硼酸0.02，氯化钴0.5，氯化锌20，七水硫酸亚铁65，生物素0.2，浓硫酸9.2，以上单位均为g/L；

4)第二阶段为诱导阶段，发酵参数为：温度25℃，pH5.5，通风量为0.5vvm，搅拌速度680-700转/分，溶氧量30％，当停加甘油混合物后，流加甲醇混合物(即每升甲醇中含有12mL PTM1)进行诱导，诱导144-146小时左右；

5)离心去除菌体，上清液即为含有耐高温壳聚糖酶的粗酶液。