[发明专利]食源性致病菌多重扩增内标序列及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的多重扩增内标序列及其制备方法，具体是一种食源性致 病菌PCR检测中的多重扩增内标序列及其制备方法。

背景技术

mIAC(multiple internal amplification control)是指多重扩增内标，即添加到 PCR反应体系中，用以指示假阴性现象的一段DNA序列或者是一段致病菌的看家基因序列。 中国加入WTO后，食品安全问题越来越成为制约我国对外贸易的主要障碍，严重地阻碍着我 国的经济发展、影响人民的身体健康，因此通过发展快速的检测技术来解决食品安全问题是 国家所需求的。但是目前我国对食品中5种重要致病菌枛副溶血弧菌、大肠杆菌O157:H7、单 核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的国标检验方法仍是采用传统的培养方法 ，由于此方法费时费力，而且灵敏度又不高，已不能满足食品加工与生产中对致病菌快速检 测的需求。

所以建立准确、快速的食源性致病菌PCR检测方法能促进我国及时、有效地进行食源性 疾病的预防、预警和控制，保障人民的身体健康。虽然随着PCR技术的不断发展、改进，此 技术已在许多方面都有了很大程度的提高，但在近来的一些应用实践中显示，PCR反应结果 常常会呈现假阴性现象，究其原因，PCR反应会因抑制剂等的影响而抑制反应的发生，造成 假阴性现象的发生，因此，在PCR检测中出现假阴性的现象就成为研究者所最为关心的问题 之一，而这一问题也一直没有得到很好的解决。

经对现有技术的文献检索发现，刘斌等人于2006年根据沙门氏菌stn基因的一段特异 DNA序列运用复合引物技术构建了扩增内标，并用于沙门氏菌的普通PCR检测(刘斌，史贤 明；扩增内标在沙门氏菌PCR检测方法中的应用.微生物学通报，2006，33：156～161) 。但由于刘斌等人用于构建内标的序列是源于沙门氏菌本身，这样难免会出现错配、同源性 交联干扰等现象；

Younes Maaroufi等于2006年建立了一种多重扩增内标合成方法，该方法运用复合引物 技术将EBV、CMV、TGO、hoPoV和HBV的特异检测引物序列依次添加到一段扩增内标序列上， 构建了同时含这五种病毒检测引物序列的多重扩增内标(Younes Maaroufi，Jean-Marc de Bruyne，Valerie Duchateau，Robert Scheen and Francoise Crokaert.Development of a multiple internal control for clinical diagnostic real-time amplification assays.FEMS Immunology and Medical Microbiology，2006，48：183～191.)  (Younes Maaroufi，Jean-Marc de Bruyne，Valerie Duchateau，Robert Scheen and Francoise Crokaert.用于临床诊断实时扩增实验的多重扩增内标的研制.FEMS免疫学与医学微生物学 .2006，48：183～191.)。而Younes Maaroufi等构建的多重扩增内标是用于临床研究方面 的，而在食品安全检测方面，添加有多重扩增内标的检测方法却还很少有人加以研究应用；