[发明专利]一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法和用途

说明书

技术领域：

本发明涉及一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法。本发明还涉及所述寡聚体在制备阿尔茨海默病的诊断试剂和治疗药物中的应用。

背景技术：

淀粉样肽寡聚体(亦称为Aβ寡聚体)被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)早期病理改变的始动因素。最新研究表明，只有低分子量Aβ寡聚体才是引起AD神经元损伤的毒性物质，高分子量聚集物和纤维成分不具有这种作用。在人体外人工制备该淀粉样肽寡聚体，有助于研究阿尔茨海默病的致病机理和治疗方法。

淀粉样肽在体外容易形成包含纤维和不具有纤维形态的高分子量或低分子量聚集物在内的混合物。这种组分不均一的混合物影响研究的准确性和可靠性。因此，获得稳定均一的低分子量Aβ寡聚体对科研工作非常重要。

众多学者曾采用多种方法制备Aβ寡聚体，但收率和效果比较低，并且所得Aβ寡聚体的成分不均一，含有较多成分的高分子量聚集物和纤维状成分，难以进一步提纯。如，利用化学交联法制备的寡聚体在成分上有差异，不能真实反应低分子量Aβ寡聚体的作用特点。而且各制备方法的条件不稳定，所得结果难以比较。有些方法和材料具有较大的不良反应，影响试验者和应用者的健康。

因此，研制一种新型人工体外淀粉样肽寡聚体制备方法，获得均一可溶性低分子量的淀粉样肽寡聚体，确有必要。

发明内容：

本发明的目的是提供一种低分子量淀粉样肽寡聚体的制备方法，直接目的是提供均一分子量的淀粉样肽寡聚体，具有特征性的超微形态和二级结构，可用于制备阿尔茨海默病的诊断试剂和治疗药物。

本发明的技术方案如下：

一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法，其特征是将Aβ多肽的单体用无水二甲基亚砜溶解后，于4℃置于缓冲体系中反应22～26小时，使其自然聚合形成寡聚体；所述缓冲体系组成是：NaCl 125mmol/L，KCl 3.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.2mmol/L，NaHCO₃26mmol/L，CaCl2 2.5mmol/L，MgSO4 2.4mmol/L，葡萄糖5mmol/L，氨基酸0.3g/L。

所述淀粉样肽特指由其前体蛋白APP(amyloid precourcer protein)经过蛋白酶降解形成的表观分子量为4kD的多肽；

本发明所用的缓冲体系是改良的人工脑脊液，在传统人工脑脊液的基础上调整了葡萄糖和氨基酸含量，其改良后的组成接近于正常脑脊液，有利于模拟体内生理条件。

最佳反应时间为24小时。

所得寡聚体是在透射电镜下观察为直径100nm以下的球形颗粒物，分子量为16～40kD。

所述Aβ多肽的单体可以用传统的化学合成方法制备，如，以Aβ42为原料，通过六氟异丙醇(1，1，1，3，3，3-hexafluoro-2-propannol，HFIP)的作用使其单体化。

所述Aβ42基因序列是已知的，Genebank登录号BC065529；

本发明提供了一种用基因重组的方法得到淀粉样肽单体，更为经济和环保，所得到的淀粉样肽单体质量更好，方法是：在N端加组氨酸标签(6×His)，C端加终止子序列TGA，构建Aβ42单体表达载体，按照常规方法在大肠杆菌表达体系内表达，用Ni柱纯化目的多肽。然后于室温下将Aβ42单体溶于冰预冷1～2h的六氟异丙醇，通过送风挥发，完全除去六氟异丙醇，形成肽膜。

本发明所制备的人工体外淀粉样肽寡聚体在电子显微镜下分析，可以看到纳米级的微粒。利用圆二色谱(Circular dichroism，CD)法分析其二级结构，可以检测到特征性的寡聚体负峰。

利用蛋白免疫印迹的方法可以验证制备出分子量在16.5kD范围内的Aβ寡聚体。

本研究首先构建了Aβ单体的原核表达杂载体，诱导表达并且纯化后，通过HFIP将其单体化，用蛋白免疫印迹的方法验证获得了所需的单体。

本发明对制备的人工体外淀粉样肽寡聚体进行了如下实验：

1、免疫印迹(Western blot)实验

目的：验证所得寡聚体是成分均一的，并且具有免疫反应性。

结果显示：所得寡聚体能够被抗人Aβ单克隆抗体6E10特异性识别，并且在16.5kD左右的范围内有均一条带(见实施例3)。说明所得寡聚体是低分子量的均一成分，并且具有免疫反应性。

用于蛋白质免疫印迹的最佳淀粉样肽寡聚体样品质量为5μg/孔。

2、透射电镜检测

目的：验证所得寡聚体是纳米级的均一微粒。