[发明专利]一种马哈利CDR-1樱桃砧木分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物品种分子鉴定技术领域，尤其涉及一种马哈利CDR-1樱桃砧木分子鉴定方法。

背景技术

“秦樱1号”甜樱桃品种1998年由陕西省果树研究所樱桃课题组最初发现，从波兰特品种的自然芽变优株经无性繁殖选育而来，属自然突变种。1999年至2001年以西安灞桥、蓝田及咸阳三原为试验地进行试验。2001至2004年，在以上三地区进行区试。2004年5月通过了杨凌农业高新技术产业示范区组织的验收鉴定。2006年通过了陕西省林木品种审定委员会审定。

甜樱桃(Prunus avium L)原产于欧洲东部及亚洲西南部，其栽培品种具有成熟早、果粒大、颜色鲜艳、酸甜适中、品质优、营养丰富等特点，在生产上发展很快。但由于早期对甜樱桃苗木缺乏可靠的品种鉴定方法，致使出现同物异名和同名异物现象，品种混乱问题对樱桃生产造成很大的损失。一般的无性系甜樱桃品种在苗木期间从形态上很难准确进行鉴别，往往要等3年以上果树开始结果以后根据果实性状来鉴定品种，鉴定周期过长[1]。因此，快速准确地鉴别甜樱桃良种已成为当前樱桃生产中急需解决的问题。Gerlach研究表明，欧洲甜樱桃种内各品种之间在分子水平上存在着显著的差异，从DNA水平上直接检测其差异，并用于无性系品种的鉴别最为可靠[4]。由于甜樱桃的抗逆性、早果性和矮化性均低于马哈利樱桃(P.mahaleb)、酸樱桃(P.cerasus)、中国樱桃(P.pseudocerasus)以及甜樱桃与中国樱桃的种间杂交种“寇尔特”砧木，在生产上，甜樱桃栽培品种需要利用后几种作砧木进行栽培，因此，对甜樱桃及其砧木进行遗传分析具有重要意义。

一般的无性系甜樱桃品种在苗木期间从形态上很难准确进行鉴别，现有技术往往要利用嫁接技术，嫁接后等3年以上果树开始结果以后根据果实性状来鉴定品种，鉴定周期过长。

随机扩增多态性DNA(RAPD)是一种有效的分子标记方法，具有快速、稳定、费用低的特点，已被用于分析园艺作物的遗传图谱。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于基因组RAPD分析的马哈利CDR-1樱桃砧木分子鉴定方法。

本发明技术方案如下：

一种马哈利CDR-1樱桃砧木分子鉴定方法，包括以下步骤：

1)取样及样品处理；

采用带木质芽接繁殖技术进行繁殖各种不同樱桃品种，随机选取生长状况一致的无性繁殖系个体5株，每株采集20片新梢顶部新鲜幼叶放入冰盒，迅速带回实验室置于-80℃超低温冰箱中储存备用；

2)DNA提取及其纯度和浓度检测；

樱桃总DNA的提取以生长期幼叶为材料，每个个体取鲜叶0.2g，采用改良2×CTAB法提取总DNA，并略加修改；使用0.6％琼脂糖对所获基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度；然后将备用DNA溶于适量0.1×TE缓冲液中，在-20℃保存；

3)引物筛选和RAPD分析；

在对樱桃进行RAPD分析的PCR扩增体系优化后，选取3个在形态上差异比较大的樱桃品种进行RAPD引物筛选，从130个随机引物中筛选出46个扩增带清晰、多态性明显、重复性好的引物进行PCR扩增；在T Gradient PCR扩增仪上进行DNA扩增；扩增产物用1.6％、含0.5μg/ml EB的琼脂糖凝胶电泳分离2-3h，电压为6V/cm；在UV光下检测扩增结果并通过凝胶成像系统(Kodak Scientific Imaging Systems，USA)照相，分别得到随机扩增多态DNA标准图谱；

4)分析标准图谱得到“秦樱1号”两个特有RAPD引物，分别是OPH13和OPAO15引物；OPH13引物扩增出的特有DNA指纹的大小为908bp；OPAO15引物扩增出的特有DNA指纹的大小为966bp；

5)将待鉴定的樱桃新品种按照上述步骤进行分析，得到所需要鉴定樱桃新品种的随机扩增多态DNA图谱，将此随机扩增多态DNA图谱与标准图谱比较判定，可以判断是否为樱桃新品种秦樱1号。