[发明专利]一种乳酸菌启动子探针载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌启动子探针载体及其构建方法，为高效乳酸菌启动子的筛选提供有效的工具。

背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌通称，广泛应用于食品、医药和饲料工业，尤其发酵乳制品生产。随着基因工程技术的发展，改良乳酸菌发酵性能和益生性能工程菌株的构建已取得了可喜进展。高效稳定的表达载体是乳酸菌工程菌株获得的基础，而启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传元件。因此，为了构建具有自主知识产权的高效乳酸菌表达系统，广谱高效乳酸菌启动子的获得尤为重要。

目前资料报道的乳酸菌启动子的筛选方法主要包括构建基因组文库、构建人工启动子文库以及通过已知基因推测其启动子三种方法，但是无论哪种筛选启动子的方法皆依赖于启动子探针载体来验证启动子的功能和分析启动子的活性。所谓启动子探针载体是指携带报告基因、抗性标记和转录终止子，但无启动子的克隆载体。因此，将一段已知的核苷酸序列插入报告基因上游时，可通过检测报告基因的表达情况判断插入序列是否具有启动子活性，并可通过定量分析报告基因的表达量确定启动子的强度。因此，启动子探针载体的构建为筛选高效启动子奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳酸菌启动子探针载体。

本发明的另一个目的在于提供构建上述启动子探针载体的方法。

本发明乳酸菌启动子探针载体，其以乳酸菌表达载体为出发载体，插入报告基因，同时删除该表达载体上的启动子获得。

在本发明优选的实施方式中，所述乳酸菌表达载体为pMG36e，所述报告基因为gusA，删除的表达载体自身启动子为P32，构建得到乳酸菌启动子探针载体pMGPP。

本发明还提供上述探针载体的构建方法，其以乳酸菌表达载体为出发载体，插入报告基因，同时删除该表达载体上的启动子获得。

在本发明的一个实施方案中，以乳酸菌表达载体pMG36e为出发载体，插入β-葡萄糖醛酸酶基因gusA作为报告基因，并删除该表达载体自带启动子P32。

上述gusA基因可以以植物表达载体pBI121为模板，用下述引物扩增得到：

上游引物gus-F5’-TCATTTGGAGAGAACACGGG-3’

下游引物gus-R5’-CCCAAGCTTAATCATAAAAACCCAT-3’

进而，通过酶切位点Xba Ⅰ和HindⅢ将扩增得到的gusA基因与乳酸菌表达载体pMG36e进行连接，得到质粒pMG36eGUS。

最后，启动子P32的删除是利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pMG36eGUS，回收的大片段用Klenow Fragment进行平滑化形成钝端，进一步用T4DNA连接酶连接而实现。

将已知的嗜酸乳杆菌S-layer蛋白基因启动子slpA插入到pMGPP无启动子的gusA基因上游验证其功能，GUS染色结果表明：pMGPP在大肠杆菌KW1(购自瓦赫宁根大学)和植物乳杆菌中皆具有启动子探针载体的功能。因此，具有自主知识产权的启动子探针载体pMGPP的构建不仅为筛选乳酸菌启动子提供了有效的工具，同时为高效乳酸菌表达载体的构建奠定基础。

附图说明

图1为重组质粒pMG36eGUS的酶切鉴定图，其中，M：DNA分子量标准DL15000；1：基因gusA的PCR产物；2：载体pMG36e双酶切/XbaⅠ和HindⅢ；3：重组质粒pMG36eGUS双酶切/XbaⅠ和HindⅢ。

图2为启动子探针载体pMGPP构建流程图。

图3为重组质粒pMGGS PCR鉴定图，其中，M：DNA分子量标准DL2000；1：slpA启动子扩增产物；2：阴性对照；3：以pMG36eGUS为模板slpA扩增产物；4：以pMGGS为模板slpA扩增产物。

图4pMGPP在大肠杆菌KW1中功能验证，其中1：空E.coliKW1；2：携带pMGPP E.coli KW1；3：携带pMGGS E.coli KW1。

图5pMGPP在植物乳杆菌中功能验证，其中，1：空植物乳杆菌；2：携带pMGPP的植物乳杆菌；3：携带pMGGS的植物乳杆菌。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1乳酸菌启动子探针载体pMGPP的构建