[发明专利]一种比法卢定的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽固相合成领域，尤其涉及比法卢定(Bivalirudin)的固相合成方法。

背景技术

在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上；在去保护剂的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过试剂活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。

凝血酶抑制剂被认为是很有前途的抗血栓药：通过凝血酶进行的蛋白水解过程是血液凝结控制的关键所在。抗凝血肽比伐卢定(bivalirudin)，即所谓的“二价水蛭素(hirulog)”。水蛭素是一种获自吸血水蛭-医用水蛭Hirudo medicinalis的有效治疗性凝血酶肽抑制剂，其包含20个氨基酸，属于强有力的凝血酶直接抑制剂。比伐卢定(bivalirudin)是一种近年来应用于临床的直接凝血酶抑制剂，于2000年批准在美国上市，其有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，作用可逆而短暂。比法卢定可以作为普通肝索和血小板糖蛋白II b/lI a拮抗剂的替代药物应用于非高危患者的经皮冠脉介入治疗。

US20070093423A公开了一种多肽固相合成比法卢定的方法，其采用固液相合成方法，将Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly和Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu两个片段耦合反应形成比法卢定。该方法的成本较高，产生的杂质多，产品纯度有限。

US20090062511A公开了一种固相合成比法卢定的方法，其采用固相合成方法，操作繁琐，产生的杂质多。

因此，本领域迫切需要提供一种多肽固相合成比法卢定的新方法，其成本低廉、得到的比法卢定纯度高，可以有效去除HPLC主峰前、后的[Bivalirudin-Gly](即Bivalirudin少一Gly)和[Bivalirudin+Gly](即Bivalirudin多一Gly)杂质。

发明内容

本发明旨在提供一种多肽固相合成比法卢定(Bivalirudin)的制备方法。

本发明提供了一种比法卢定(Bivalirudin)的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)在缩合剂存在下，将Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH和如式V所示的多肽树脂缩合，得到如式III所示的多肽树脂；

(2)将如式III所示的多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；

(3)在缩合剂存在下，将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和如式VI所示的多肽树脂缩合，得到如式IV所示的多肽树脂；

(4)通过固相合成的方法将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的顺序依次同如式IV所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成如式II所示的多肽树脂；和

(5)在切割剂的存在下，使式II所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的比法卢定；

其中，所述的Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH通过下述步骤得到：

(i)将Z-Asn(Trt)-OH和H-Gly-OBzl.TosOH混合，进行液相多肽缩合，得到Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl；

(ii)将Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl进行氢化还原，得到H-Asn(Trt)-Gly-OH；和

(iii)将H-Asn(Trt)-Gly-OH和Fmoc保护基混合，得到Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH。

所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH通过下述步骤得到：

(a)将H-Gly-Gly-OBzl和Z-Gly-Gly-OH混合，进行液相多肽缩合，得到Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl；