[发明专利]一种致病微生物快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种致病微生物快速检测试剂盒。

背景技术

近年来，重大食品安全事件频发，引起人们的高度重视。要从根本上解决食品安全问题，就必须对食品的生产、加工、流通和销售等各环节实施全程管理和监控，这就需要大量能够满足这一要求的快速、方便、准确、灵敏的食品安全分析检测技术。

随着科学技术的发展，食品安全快速分析检测方法在食品卫生检验方面的作用越来越重要。从长远发展来看，免疫学、分子生物学、计算机技术与自动化等学科的发展极大地推动了食品安全分析检测方法向更灵敏更便捷的方向发展，建立高效的食品安全快速分析检测方法，对食品生产、运输、销售过程中的质量控制具有十分重要的意义；同时一旦发生食源性致病微生物中毒事件，也需要在最短时间内完成检测以制定科学合理的治疗方案，赢得治疗时间。这些快速分析检测技术的推广应用，不仅是对传统的食品安全分析检测技术的一个改进和提高，也使食品质量安全有了进一步的保证，从而推动食品工业更加健康、快速地向前发展，不断满足人民提高健康水平的需要。

目前现有的一些食源性致病菌快速检测技术大多是利用免疫学方法，该方法仪器操作简单、检测速度快、灵敏度较高、特异性较好且样品所需量少，但也存在着如致病菌单克隆抗体难以制备、使用多抗易产生交叉反应出现假阳性以及一次只能检测一种或几种致病菌等缺点和不足。因此，目前还需要开发可快速地、高效地检测致病菌的新技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种致病微生物快速检测方法以及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种微生物快速检测方法，所述的方法包括：

(1)针对待检测的1-50种(较佳地2-30种，如10种、15种、20种)微生物，分别确定特异性靶基因；

(2)根据步骤(1)确定的每一靶基因，分别确定其特异性的一对内侧引物(正向内侧引物(Fi)与反向内侧引物(Ri))和一对外侧引物(正向外侧引物(Fo)与反向外侧引物(Ro))，所述内侧引物的序列既能与相应的靶基因部分互补，又能与相应的超级引物部分互补(即正向内侧引物与正向超级引物部分互补，反向内侧引物与反向超级引物部分互补)；所述的超级引物为一引物对，正向超级引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向超级引物序列如SEQ ID NO：2所示；混合上述引物，得到引物混合物；

(3)以待测样品为PCR模板，以步骤(2)的引物混合物为引物进行PCR反应，得到PCR扩增体系；

(4)在步骤(3)的PCR扩增体系中加入带有可检测信号的探针，所述的探针能特异性地与对应的靶基因互补，并且针对不同的靶基因可检测信号不同；

(5)鉴定可检测信号，从而确定微生物的种类。

在一个优选例中，所述的微生物是致病菌(不包括病毒)。

在另一优选例中，所述的反向超级引物的5’端带有一可识别信号；较佳地为生物素标记。

在另一优选例中，步骤(3)中，正向超级引物的量(条数)是每一靶基因对应的引物的3-10倍；较佳地为4-6倍；更佳地为5倍，反向超级引物的量(条数)是每一靶基因对应的引物的10-50倍；较佳地为10-30倍；更佳地为20倍。

在另一优选例中，反向超级引物的量是正向超级引物的4倍。

在另一优选例中，所述的微生物靶基因及其对应的引物和探针如下：

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)诱导肌动蛋白组装前体蛋白基因，引物如SEQ ID NO：8-11所示，探针如SEQ ID NO：12所示；

志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒H抗原基因，引物如SEQ ID NO：13-16所示，探针如SEQ ID NO：17所示；

沙门氏菌(Salmonella)侵袭蛋白A基因，引物如SEQ ID NO：18-21所示，探针如SEQ ID NO：22所示；

变形杆菌(Bacillus proleus)F型ATP酶β亚基基因，引物如SEQ ID NO：23-26所示，探针如SEQ ID NO：27所示；

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)肠毒素T基因，引物如SEQ ID NO：33-36所示，探针如SEQ ID NO：37所示；

大肠杆菌ETEC(Escherichia coli ETEC)不耐热肠毒素AB亚单位基因，引物如SEQ ID NO：43-46所示，探针如SEQ ID NO：47所示；