[发明专利]一种致病微生物快速检测试剂盒

权利要求书

1.一种微生物快速检测方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)针对待检测的1-50种微生物，分别确定特异性靶基因；

(2)根据步骤(1)确定的每一靶基因，分别确定其特异性的一对内侧引物和一对外侧引物，所述内侧引物的序列既能与相应的靶基因部分互补，又能与相应的超级引物部分互补；所述的超级引物为一引物对，正向超级引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向超级引物序列如SEQ ID NO：2所示；混合上述引物，得到引物混合物；

(3)以待测样品为PCR模板，以步骤(2)的引物混合物为引物进行PCR反应，得到PCR扩增体系；

(4)在步骤(3)的PCR扩增体系中加入带有可检测信号的探针，所述的探针能特异性地与对应的靶基因互补，并且针对不同的靶基因可检测信号不同；和

(5)鉴定可检测信号，从而确定微生物的种类。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反向超级引物的5’端带有一可识别信号。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，正向超级引物的量是每一靶基因对应的引物的3-10倍，而反向超级引物的量是每一靶基因对应的引物的10-50倍。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物靶基因及其对应的引物和探针如下：

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)诱导肌动蛋白组装前体蛋白基因，引物如SEQ ID NO：8-11所示，探针如SEQ ID NO：12所示；

志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒H抗原基因，引物如SEQ ID NO：13-16所示，探针如SEQ ID NO：17所示；

沙门氏菌(Salmonella)侵袭蛋白A基因，引物如SEQ ID NO：18-21所示，探针如SEQ ID NO：22所示；

变形杆菌(Bacillus proleus)F型ATP酶β亚基基因，引物如SEQ ID NO：23-26所示，探针如SEQ ID NO：27所示；

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)肠毒素T基因，引物如SEQ ID NO：33-36所示，探针如SEQ ID NO：37所示；

大肠杆菌ETEC(Escherichia coli ETEC)不耐热肠毒素AB亚单位基因，引物如SEQ ID NO：43-46所示，探针如SEQ ID NO：47所示；

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)热稳定性核酸酶基因，引物如SEQ ID NO：53-56所示，探针如SEQ ID NO：57所示；

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)促旋酶A亚基基因，引物如SEQ IDNO：63-66所示，探针如SEQ ID NO：67所示；

大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)O-抗原特异性基因，引物如SEQ IDNO：73-76所示，探针如SEQ ID NO：77所示；

结肠弯曲杆菌(Campylobacter.Coli)含铁细胞转运相关蛋白基因，引物如SEQ ID NO：83-86所示，探针如SEQ ID NO：87所示；

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)黏附侵袭蛋白基因，引物如SEQ ID NO：88-91所示，探针如SEQ ID NO：92所示；

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)溶血素蛋白A基因，引物如SEQ ID NO：93-96所示，探针如SEQ ID NO：97所示；或

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticu)耐热溶血毒素基因，引物如SEQID NO：98-101所示，探针如SEQ ID NO：102所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应过程如下：

(a)90-99℃进行15±2min；

(b)90-99℃进行30±3sec→50-65℃进行2±0.5min→72℃进行60±5sec；共10-30个循环；

(c)90-99℃进行30±3sec→65-72℃进行90±5sec；共3-20个循环；

(d)90-99℃进行20±2sec→50-65℃进行20±2sec→72℃进行30sec；共25-45个循环；

(e)72℃，3±0.5min。