[发明专利]鸡FSHR基因5′调控区两个突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡FSHR基因5′调控区的两个突变位点的分子标记方法及其育种中的应用。

背景技术

促卵泡素(FSH)是调控动物繁殖活动的重要激素之一，对动物卵巢卵泡的生长、发育、分化、成熟和排卵起着必不可少的作用，其生物学功能的发挥通过位于靶细胞膜上的促卵泡素受体(FSHR)介导。有研究表明，FSHR基因5′端多态位点的基因频率，在产双胎和产单胎的中国西门塔尔牛群体中差异显著。研究发现，多胎罗曼诺夫羊发育卵泡颗粒细胞中的FSHR mRNA水平均显著高于单胎法兰西岛羊，且颗粒细胞对促性腺激素反应的敏感性，前者也高于后者。雷雪芹等用FSHR基因5′端侧翼序列的PCR-RFLP标记对牛进行了研究，结果在秦川牛和黑白花奶牛两个品种中出现优势等位基因不一致的现象，即在秦川牛中双胎母牛的A基因频率和AA基因型频率分别高于单胎母牛的A基因频率和AA基因型频率。魏伍川等发现小尾寒羊表现为无Taq I酶切序列的B等位基因类型，所有个体均为BB型，FSHR基因转录启动调控区的B型DNA序列对提高双胎率有正效应。目前，有关FSHR基因5′端的研究主要集中在哺乳动物，如：小鼠、牛、羊等，在禽类仅有报道产蛋鸡FSHR在成熟卵巢不同等级卵泡膜细胞和颗粒细胞上的表达，而有关FSHR 5′调控区序列多态性及其与产蛋性状关系的研究尚未见报道。

基因表达是DNA上的遗传信息转录和翻译的过程，转录受基因5′端序列的调控，碱基突变通常会影响基因转录调控，因此5′端的序列结构变异直接关系到基因的表达。对不同突变位点进行整体研究，即由这些不同位点构成的单倍型，更有利于发现基因与某种表型的相关性。如药物代谢酶P450 2D6(CYP2D6)基因中存在3个SNPs，这3个SNPs中的任何一个对酶功能几乎没有影响，但是由它们构成的单倍型可使酶活性丧失80％左右，可见单倍型分析的重要性，张森等研究也表明单倍型相关性分析方法在QTL检测中要明显的优于单标记分析。而对于禽类，特别是鸡的FSHR基因5′调控区研究现在还相对较少，无法将其应用于鸡的育种等工作中。

发明内容

根据现有技术，发明人进行了进一步的研究和实验，最终发现鸡FSHR 5′调控区-237和-868位点进行单个位点标记分析时，两位点均未发现与性状相关，但用两位点单倍型构建双倍型进行多重比较时，结果发现TTG+G-型对应较小的开产日龄(123d)，TTG+G+型对应较大的开产日龄(134d)，两者差异显著(P＝0.016)，可见检测这两个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

本发明的具体标记方法是：

采用标记引物P-868，包括

P-868F：5′-TGAGTCAACATCAGCAGAG-3′其序列如Seq ID No：1所示；

P-868R：5′-GGAAGGAGTGTGAAGACC-3′其序列如Seq ID No：2所示；

扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物得到大小相差200bp的两个片段分别为1119bp的片段和919bp的片段(其序列如Seq ID No：3和Seq ID No：4所示)，PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测直接分出三种带型，200bp插入的记为G+G+型，200bp缺失的记为G-G-型，杂合子记为G+G-型；

采用标记引物P-237，包括

P-237F：5′-GGATCTATGAAGGGGAGCAT-3′其序列如Seq ID No：5所示；

P-237R：5′-AAGCTGAGATGGAACACGTG-3′其序列如Seq ID No：6所示；

扩增鸡育种材料的基因组DNA，得到371bp的PCR扩增产物(其序列如Seq ID No：7所示)，其中包含Ssp I限制性内切酶的识别序列“AAT/ATT”，当-237“T”突变为“A”即“AAT/AAT”类型记做“AA”，扩增片段Ssp I内切酶切不开；“T”不发生突变类型记做“TT”，可以被Ssp I内切酶切作235bp和136bp的两条短片段；PCR产物被Ssp I限制性内切酶消化后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，即得到AA、TT、AT三种带型；

选择两位点单倍型组合为TTG+G-的个体用于留种，其可提高总体产蛋量。

通过这种标记方法选择的TTG+G-基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有意增加TTG+G-的频率对提高产蛋量是一个有效措施，而对于开产较晚的群体，这样的措施会使其开产适当提前，从而实现早期选种。