[发明专利]食品和饮料中胡萝卜成分快速检测试剂盒的制备和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行植物源性成分快速检测的方法，具体是一种胡萝卜成分实时荧光PCR检测用的引物和探针序列。

背景技术

全球经济一体化和贸易国际化的的不断扩大，对于发展中的中国，是机遇也是挑战。目前，我国已成为世界上第五大农产品出口国，农产品进出口贸易持续增长。美国、欧盟、日本等发达国家和地区为了维护本国的经济利益，争夺国际市场，竭力通过名目繁多的检验项目和严格甚至苛刻的技术标准，对进口农产品设置贸易障碍，导致我国农产品出口增长遭受较大压力。就进出口的农产品而言，合格的产品，不仅要无毒无害，满足安全卫生要求；而且要无搀杂搀假，满足品质要求。其中品质合格，又主要包含两方面的含义：1.原料来源与标签一致。2.组分含量与标签一致。欧盟自2006年1月1日起开始实施新的食品卫生法规，新法规突出了食品生产过程中的可追溯管理与食品的可追溯性，强调食品的身份鉴定标识与健康标识。我国国家标准GB 7718-94《食品标签通用标准》和国家出入境检验检疫局发布的《进出口食品标签管理办法》，也明确提出食品标签标注内容应与食品相符。为此，国家质检总局专门发文，要求严厉打击制假制劣的违法行为，对假冒伪劣产品要依法没收并监督销毁，追查生产源头和去向，严防流入消费环节。

在食品和饮料的生产与销售中，产品无标签或标签不规范，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者谋取暴利的事件，国内、国外均屡屡发生。各种原料被加工成食品和饮料成品后，已无法从外观对其组成进行鉴定。生产者受利益驱动，擅自改变产品组成，或掺入价廉的替代品，或直接减少原料用量，导致产品的真实属性与标签不符。这种造假行为不仅仅涉及经济、营养价值，更直接影响着消费者的健康，可能引发食源性过敏反应。

胡萝卜是一种质脆味美的家常蔬菜，素有“小人参”之称，其富含糖类、脂肪、挥发油、胡萝卜素、维生素A、维生素B1、维生素B2、花青素、钙、铁等多种营养成分，常作为食品配料用于制作各种糕点、面食和饮料。胡萝卜虽营养丰富，但同时也是一种常见的食物过敏原。有文献报道，胡萝卜、苹果、大豆、榛子、猕猴桃、小麦是柏林人最常见的食物过敏原。瑞士专家报道，大约25％的食物过敏者会对胡萝卜产生过敏反应。《亚运食品安全食品过敏原标识标注》地方技术规范已于2009年颁布实施，规范列出可导致过敏反应的食品名单，要求含有名单上过敏原的亚运食品必须如实标注，胡萝卜位列其中。鉴于此，尽快建立可靠有效的胡萝卜成分检测方法，确保食物标签真实准确，对于减少食源性过敏反应发生，加强食品过敏原标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。

食品中植物源性成分检测，常采用DNA检测的方法。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在食物成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受食物基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样受地理条件、季节变化和加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法 中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种胡萝卜成分快速检测试剂盒的制备和检测方法，克服基于蛋白的检测方法在某些食品检测中的局限性，为胡萝卜成分检测提供有效工具，从而确保食品标签的一致性和消费者的饮食安全。

本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物(上游引物：5′-CGACAAGCAAGCTTTACTCCAA-3′和下游引物：5′-CGTCTGACACCCATGAGTCTGT-3′)和一条Taqman探针(序列为：5′-FAM-TCAAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCA-TAMRA-3′)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。

本发明涉及的胡萝卜成分快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下：

(1)PCR扩增反应液A