[发明专利]海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法，针对海洋无脊椎动物海绵细胞内共生放线菌进行原位基因水平上的鉴定。属于海洋分子生态学技术领域。

背景技术

海绵具有独特的腔状结构，以滤食海水中的微生物为生，体内聚集了大量的共生微生物，一般可以达到海绵体积的40％以上。许多证据表明，海绵来源的药用天然产物可能是其共生微生物产生的，海绵共生微生物也因此成为了海洋药物研发的重点之一。对这些微生物的多样性进行分析，鉴定出具有宿主特异性的微生物是开发利用海绵共附生微生物资源的前提。早期人们主要通过纯培养的技术来分离、鉴定海绵中的微生物。尽管通过改进培养条件、延长培养周期等于段可以获得一些新颖的微生物，但是海洋中的微生物的可培养性不到1％，因此这种方法很大程度上不能满足人们了解海绵共生微生物多样性的要求。以聚合酶链式反应(PCR)和核糖体RNA小亚基(16S/18S rRNA)基因序列分析为核心的现代分子生态学技术可以绕开海洋微生物难培养的障碍，提供较为全面的多样性信息。目前常用技术有变性梯度凝胶电泳(DGGE)、末端限制性长度多态性分析(T-RFLP)和克隆文库技术。DGGE技术虽然可以快速的揭示海绵共生微生物的组成，但对于低丰度的类群敏感性较低，且获得的种属信息相对少；T-RFLP技术可以较快的获取大量多样性信息，但是成本高，结果分析较繁琐；克隆文库技术可以获取较为全面的种属信息，并且时间成本和资金成本适中，且可以根据需求，克隆一些非核糖体RNA的管家基因，丰富多样性的结果。人们应用这些分子生态学技术来研究海绵共生微生物多样性取得了很大的进展，但是很难通过得到的多样性信息认识到海绵共生微生物的生态学功能。就多样性研究来说，人们常常忽视了海绵细胞内的共生微生物。海绵细胞内的共生微生物可以直接与海绵宿主发生作用，对于宿主的表型有非常大的影响。因此，研究海绵细胞内部微生物的组成，对于认识海绵共生微生物的功能以及海绵共生微生物-海绵宿主的相互作用有着非常重大的意义。

放线菌作为药用天然产物的重要来源，在海绵中广泛存在。许多分离自海绵的放线菌都具有一定抗菌活性和酶活性；系统发育分析表明，在这类微生物中经常发现海绵特异性类群。因此，海绵中的放线菌是一类非常重要的、有代表性的功能性共生微生物。但在海绵共生微生物多样性研究中，放线菌却经常得不到足够的重视，在现代分子生态学研究中，缺乏应用放线菌种属特异性引物的应用，人们很少得到较为全面、完整的海绵放线菌多样性信息和分布特点。

综上所述，海绵细胞内共生放线菌是一类十分重要却又缺乏足够研究的微生物类群。研究海绵细胞内共生放线菌的多样性，探究海绵细胞内共附生放线菌的组成，发现海绵胞内特异性的放线菌，不仪可以完整人们对于海绵共附生微生物多样性的认知，也更有利于分析海绵共生放线菌的功能和分离培养这类具有很大生物技术潜力的微生物。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种海绵细胞内共生放线菌的分子检测，能较为全面、准确的对海绵细胞内共生放线菌进行分子检测。

为实现这一目的，本发明将机械法与化学法相结合，获取海绵单细胞，按经典的酶解法提取海绵细胞内共生微生物总DNA；以提取的总DNA为模板，以放线菌种属特异性引物S-C-Act-235-S-20/S-C-Act-878-A-19聚合酶链式反应扩增放线菌16S rRNA基因片段；将扩增产物纯化后构建克隆文库，随机挑取阳性克隆进行测序至文库饱和，将测序结果上传到RDP核糖体数据库中进行嵌合体检验和同源性搜索，确定最相近序列和分类地位，将测序结果及其最相近序列导入ARB序列分析软件包中进行系统发育分析，完成海绵细胞内共生放线菌的分子检测。

本发明的方法具体包括如下步骤：