[发明专利]海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法

权利要求书

1.一种海绵细胞内共生放线菌的分子检测方法，其特征包括如下步骤：

1)在无菌条件下，将海绵组织于4℃以下解冻后切成不超过0.5cm3的小块，加到盛有人工海水的锥形瓶中，海绵组织与人工海水的体积比为1∶15-20，110rpm，20℃以下振荡、洗涤40min-60min；将洗涤后的海绵小块于200目的不锈钢细胞筛网上轻轻摩擦进行机械解离，同时用20-25倍于海绵体积的无钙镁人工海水冲洗，冲洗液转入锥形瓶中110rpm，20℃以下振荡、解离40min-60min，得到海绵细胞的粗悬液；粗悬液经300g，5min离心后收集沉淀，再用无钙镁人工海水洗涤三次，300g，5min离心获得包含海绵细胞内内共生微生物的海绵细胞；所述无钙镁人工海水的组分为31.6g NaCl，0.75g KCl，1.0g Na₂SO₄，2.4gTris-HCl，0.02g NaHCO₃，7.2g EDTA，1L去离子水，pH 7.6；

2)对获得的海绵细胞采用TE溶液洗涤、离心，取压积20-30μl的细胞沉淀，采用酶解法破壁后用酚氯仿抽提法提取细胞内内共生微生物总DNA；

3)以提取的DNA为模板，以S-C-Act-235-S-20(5′-CGC GGC CTA TCAGCTTGTTG-3′)/S-C-Act-878-A-19(5′-CCG TAC TCC CCA GGC GGGG-3′)为引物采用聚合酶链式反应扩增放线菌16S rRNA基因片段；

4)将扩增产物纯化后构建克隆文库，随机挑取阳性克隆测序至文库饱和，将测序结果上传到RDP核糖体数据库中进行嵌合体检验和同源性搜索，剔除嵌合体，确定最相近序列；

5)把测序结果及其最相近序列导入ARB序列分析软件包中，采用最大似然性法进行系统进化分析，确定不同放线菌的分类地位，并观察聚类情况，揭示出海绵细胞内特异性的放线菌，完成海绵细胞内共生放线菌的分子检测。