[发明专利]一种耐受高浓度丙酮酸及低pH的酵母菌及选育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高耐受性的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)，特别涉及一株耐受高浓度丙酮酸及低pH胁迫的光滑球拟酵母；本发明还涉及到一种选育高耐受性的光滑球拟酵母的方法，特别涉及选育高浓度丙酮酸及低pH耐受性光滑球拟酵母的方法。 

背景技术

发酵法生产丙酮酸从50年代起开始研究，取得不少成果。采用发酵过程优化和代谢工程改造原理，以丙酮酸高产量，高得率和高生产强度相统一为目标，对多重营养缺陷型菌株T.glabrata生产丙酮酸的发酵过程进行了大量优化和改造的研究工作，使丙酮酸产量大幅度提高。但随着丙酮酸产量的提高，随之而来的问题是酵母对于低pH值和高浓度丙酮酸的敏感性。 

通常来说，在有机酸发酵过程中，为了维持发酵体系pH处于最适范围而流加一定量NaOH等碱性物质，且随着NaOH等流加，导致发酵液渗透压不断升高；而发酵液中渗透压达到一定浓度时，细胞进一步积累有机酸的能力和速度将逐渐下降，难以达到最大理论产量。尽管生物反应与产物分离组合技术能提高生物反应过程性能和效率，但该方法的适用范围和高额的设备费用限制了其在大规模工业生产中的应用。为进一步提高丙酮酸产量和产率，需要降低发酵过程中丙酮酸的抑制或提高细胞耐低pH胁迫能力。 

适应性进化技术(Adaptive evolution)是近几年来飞速发展的提高菌株在环境胁迫条件下耐受性的一种育种技术，如高渗透压，氧胁迫，高底物浓度，高乙醇等。本发明通过适应性进化技术(Adaptive evolution)提高光滑球拟酵母对高浓度丙酮酸，低pH胁迫耐受性，取得了出人意料的效果，对丙酮酸的工业化生产有着极其重要的意义。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高浓度丙酮酸及低pH条件下耐受性的光滑球拟酵母 (Torulopsis glabrata WSH501)，于2010年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M 2010061,地址：中国武汉，武汉大学。 

光滑球拟酵母CCTCC M 2010061在低pH(pH≤5.5)条件下，发酵结束后菌体量和丙酮酸产量都有明显提高。 

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种选育上述光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)的方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：以光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)CCTCC M 202019为出发菌株，将其在种子培养基中培养至对数生长期，置于含20g/L丙酮酸钠、pH为4.5的进化培养基中培养24h后，通过恒化培养系统，按照稀释率0.1h^-1流加添加20g/L丙酮酸钠的进化培养基，当培养体系中的pH降到4.0时，按照稀释率0.1h^-1流加含30g/L丙酮酸钠的进化培养基，当培养体系中的pH升高至4.3时停止流加；当培养体系中的pH降到4.0时，按照稀释率0.1h^-1流加含40g/L丙酮酸钠的进化培养基至4.3时停止流加；当培养体系中的pH再次降到4.0时，按照稀释率0.1h^-1流加含50g/L丙酮酸钠的进化培养基至pH 4.3时停止流加。 

所述恒化培养是通过控制培养基中营养物质，主要是生长限制因子的浓度，来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。以恒定的速率流入营养物质，以恒定的速率流出培养液，从而保证了培养基化学成分的稳定，使培养系统中的微生物始终保持稳定的生长速度。 

所述恒化培养的装置称为恒化器，购自New Brunswick公司，大小为1.3L，装液量为0.7L，型号为M1273-0054。 

所述添加丙酮酸钠代替添加丙酮酸的原因，丙酮酸为酸性物质，会降低培养基pH，而且根据丙酮酸的pKa值，当pH为4.0-4.5之间，培养基中的丙酮酸钠会大部分变成丙酮酸的形式，即可选择耐受高浓度丙酮酸的菌株。 

所述种子培养基(g/L)为：葡萄糖30，蛋白胨10，KH₂PO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.5；斜面培养基添加琼脂20，pH 5.5。