[发明专利]一种番石榴焦腐病菌分子检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及番石榴焦腐病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。

背景技术

番石榴焦腐病是由番石榴焦腐病菌(Botryosphaeria rhodina)侵染引起的一种毁灭性病害，由于番石榴果实采后生理代谢旺盛，鲜果易失水、褐变和腐烂。因此，采后番石榴的保鲜运输成为生产上亟待解决的问题。研究发现番石榴采后贮藏期真菌性病害主要是由于番石榴焦腐病采前病原真菌的潜伏侵染造成的，同时认为采后病害(特别是真菌性病害)是影响番石榴果实货架期的主要原因，而且番石榴焦腐病菌的分离频率最高。该病害给番石榴的品质和外观造成极大影响，严重降低其经济价值。因此，开展番石榴焦腐病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对番石榴焦腐病的及时控制具有重要意义。

传统的番石榴焦腐病菌检测方法是采用选择性培养基从植物组织中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在番石榴焦腐病菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由番石榴焦腐病菌引起的病害。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期的需求，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期，且目前尚未见有关番石榴焦腐病菌快速检测方法技术的报道。

随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多(Li et al，2003)。18S和28S间的ITS是较理想的真菌鉴定及检测的PCR引物区域。在相近的真菌中，由于ITS序列不需翻译，面临较小的进化选择压，在进化过程中可以将突变保留积累下来，从而ITS包含许多差异序列。利用ITS序列的多态性获得的特异性引物及PCR过程可以为病原菌的快速、准确检测提供可靠的分子检测工具，检测过程只需要简便的PCR和琼脂糖电泳操作，为植物病害的防治提供依据。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中番石榴焦腐病菌的生物学检测方法所需周期长、目前番石榴焦腐病菌分子检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种番石榴焦腐病菌的特异分子检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的番石榴焦腐病菌的快速分子检测诊断的方法。该方法可用于带菌的植物组织的高灵敏度快速分子检测，此技术对于番石榴焦腐病菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1.根据番石榴焦腐病核糖体rDNA-ITS序列的特异性，设计了对番石榴焦腐病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物BF1：5′-TCCGGCCGCCAAAGGACC-3′

下游引物BR1：5′-TCTTTGAGGCGCGTCCGCA-3′。

2.番石榴焦腐病菌特异分子检测体系的建立

(1)从发病的番石榴植物组织中采用CTAB法提取DNA；

(2)以提取的DNA为模板上述的一对引物BF1/BR1通过PCR扩增；PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物BF1/BR1各0.5μmol/L和10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl；PCR反应条件为：95℃预变性1min，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min共30个循环；72℃延伸10min；

(3)然后取步骤(2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果；如果能特异性地扩增出287bp的产物，即可判断所述的植物组织中存在了番石榴焦腐病菌。