[发明专利]多重定量核酸扩增及解链测定法

说明书

技术领域

本发明整体上涉及核酸的体外扩增、检测和定量。特别地，本发明涉及单管多重测定法(single-tube multiplex assay)，其能够应用复数个被标记相同荧光报告标记的杂交探针，同时扩增、检测和定量复数个靶核酸。所述测定法可应用多种荧光报告基团来进一步复杂化(multiplexed)。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)已经成为生物医学研究、疾病监测和诊断的一种普及的工具。美国专利4,683,195、4,683,202以及4,965,188中描述了通过PCR扩增核酸序列。PCR是现今本领域众所周知的技术，并广泛描述于科技文献中(参见PCR Applications，(1999)Innis等编辑，Academic Press，San Diego；PCRStrategies，(1995)Innis等编辑，Academic Press，San Diego；PCR Protocols，(1990)Innis等编辑，Academic Press，San Diego以及PCR Technology，(1989)Erlich编辑，Stockton Press，New york)。“实时”PCR分析能够同时扩增和检测并且定量靶序列的起始量。应用DNA聚合酶的核酸酶活性的基础TaqMan实时PCR分析描述于Holland等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：7276-7280以及美国专利5,210,015。不需要核酸酶活性(无核酸酶分析)的实时PCR描述于2008年12月9日提交的美国申请系列号12/330,694。荧光探针在实时PCR的应用描述于美国专利5,538,848。

典型的实时PCR方案(protocol)涉及使用特异于每个靶序列的标记探针。优选地，探针被标记一个或更多个荧光基团(moiety)，所述的荧光基团发射可检测波长的光。在杂交至靶序列或其扩增子后，探针显示出在荧光发射上的可检测变化。

然而，在单管内分析多个靶的能力仍然是实时分析的主要挑战。几乎在医药以及诊断的每一个领域，被关注位点(loci)的数量迅速增长。例如，仅举几例，在法医DNA鉴定、病原微生物检测、多位点遗传疾病筛选以及多基因表达研究中必须分析多个位点。

利用目前的方法，多重分析的能力受限于检测仪器。特别地，相同反应中应用复数个探针要求采用不同的荧光标记。为同时检测复数个探针，仪器必须能够区分每个探针所发射的光信号。目前的技术不允许在相同反应容器中超过四个单独波长的检测。例如，Bell等(“Real-time quantitative PCR in parasitology”，Trends in Parasitol.(2002)18(8)：337-342.)最近已调查了可用的实时定量PCR热循环仪，并报道都不能具有超过四个光学检测通道。因此，每个靶应用一个独特标记的探针，在同一反应容器中可检测不超过四个单独的靶。在实践中，至少一个靶通常是对照核酸。因此，在实践中，同一管内可检测不超过三个实验靶。由于光学硬件最多允许做很小的增量改进，多重分析的能力将跟不上临床需要，除非扩增以及检测策略进行根本变革。

PCR后解链分析提供了额外的多重实时扩增反应能力(参见2006年6月23日提交的US2007-0072211)。在解链分析中，扩增的核酸通过其独特的解链曲线图(melting profile)来鉴定。解链分析涉及测定双链靶或者标记探针与靶的双链体的解链温度(解链点(melting point))。如美国专利5,871,908所描述的那样，为测定应用了荧光标记探针的解链温度，靶核酸和探针的双链体在受控温度程序下逐步加热(或冷却)。双链体的解离改变了相互作用的复数个荧光团或荧光团与淬灭剂之间的距离。相互作用的荧光团可缀合至单独的探针分子，如美国专利6,174,670所述的那样。备选地，一个荧光团可缀合至探针，而其它的荧光团可嵌入核酸双链体，如美国专利5,871,908所述的那样。作为另外一个备选，荧光团可缀合至单个探针寡核苷酸。在双链体解链后，由于此时在单链探针中荧光团与淬灭剂靠拢，因此荧光团被淬灭。