[发明专利]多重定量核酸扩增及解链测定法

权利要求书

1.在单个样品容器中同时多重实时PCR扩增、检测并定量一种或更多种靶核酸的方法，其包括步骤：

(a)使怀疑含有一种或更多种靶核酸的样品与至少一组寡核苷酸探针相接触，其中所述组内每个寡核苷酸探针被标记相同的一个或更多个报告基团，其中每个所述标记寡核苷酸探针

i.充分互补于至少一种靶核酸的至少一个子序列；

ii.能够以不同于同组内其它标记寡核苷酸探针解链温度的解链温度与相应靶核酸结合；

(b)在包括温度变化区间的扩增反应循环中扩增样品中的靶核酸，其中所述标记寡核苷酸探针从与相应靶核酸的杂合子解离；

(c)检测在至少部分所述温度变化区间上来自所述报告基团的光发射；以及

(d)对步骤(c)中在温度变化区间的至少所述部分上检测的光发射的一阶导数进行作图；

(e)确定步骤(d)中作图的所述导数的最大值；

(f)重复步骤(b)至(e)复数次；以及

(g)将步骤(e)确定的所述导数最大值相对于步骤(b)至(e)的循环数或重复数目进行作图，并确定步骤(e)中确定的数值到达预设阈值时的循环数或重复数目，从而定量所述靶核酸的相对量。

2.权利要求1所述的方法，其中对浓度已知的对照核酸与所述靶核酸同时进行步骤(a)-(f)，并且将步骤(g)中确定的每个靶核酸的值与步骤(g)中确定的对照核酸的值进行比较，从而确定每个所述靶核酸的绝对量。

3.权利要求1和2任一项的方法，其中步骤(a)中每个所述寡核苷酸探针被标记单个报告基团。

4.权利要求3所述的方法，其中所述报告基团是荧光的。

5.权利要求1和2任一项的方法，其中步骤(a)中的每个所述寡核苷酸探针被标记报告基团和淬灭基团。

6.权利要求5所述的方法，其中所述报告基团和所述淬灭基团是荧光团。

7.权利要求5所述的方法，其中所述报告基团是荧光团而所述淬灭基团是暗淬灭剂。

8.权利要求5所述的方法，其中所述报告和淬灭基团被核酸酶切割位点分隔。

9.权利要求1、2、4和6-8任一项所述的方法，其进一步包含至少一个用于在步骤(b)之前扩增样品中的靶核酸的扩增循环。