[发明专利]油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法及检测用引物

说明书

技术领域

本发明涉及农业和植物检疫技术领域，具体涉及一种油菜茎基溃疡 病菌的检测方法，尤其涉及一种油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法。此 外，本发明还涉及检测油菜茎基溃疡病菌的引物。

背景技术

油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans(即L.maculans)和油菜 黑胫病菌Leptosphaeria biglobosa(即L.biglobosa)是世界范围内引起油 菜黑胫病的两种病原菌。这两种病菌的形态特征相近，但引起油茎部感染 和基部溃疡的能力不同。油菜茎基溃疡病菌L.maculans致病力强，引起 茎基部发病。油菜黑胫病菌L.biglobosa致病力较弱，一般引起茎中上部 为害，L.maculans是导致油菜黑胫病严重流行和油菜产量损失的主要原 因。目前，我国仅有L.biglobosa分布，但是油菜的国际贸易和种子资源 交流十分频繁，我国每年都要从澳大利亚、乌克兰、加拿大等油菜茎基溃 疡病发生国进境大量油菜籽，2009年我国进境油菜总量超过320万吨。 因此，进境油菜籽中油菜茎基溃疡病菌的快速检测已经成为口岸检疫部门 的新课题。

目前油菜茎基溃疡病菌检测技术包括滤纸培养法和PCR方法，PCR 以其快速、准确和灵敏的特点受到广泛应用。Taylor(Taylor and Borgman，1993)等根据一段重复序列设计特异引物，建立了检测强致病力 菌株的PCR方法；Mahuku et al.(1995)从ITS序列设计引物来检测强毒力 的L.maculans；1995年，Mahuku等曾设计了ITS区的特异引物 HV17S/HV26C检测强毒力菌株(即油菜茎基溃疡病菌)(Mahuku et al. 1995)，序列分析发现下游引物3’端与GenBank中部分油菜茎基溃疡病菌 菌株的序列不能完全匹配。2006年，Liu等根据ITS序列设计了检测L. maculans的引物LmacF/LmacR(Liu et al.2006)，试验中应用该引物检测进 境油菜籽样品时，部分样品的扩增容易出现假阳性的结果。此外，PCR 反应的退火温度也影响扩增的特异性。

国内的油菜黑胫病是由L.biglobosa引起，主要分布于浙江、安徽、 湖北、湖南、四川和内蒙古等油菜主产省区。我国尚未发生油菜茎基溃疡 病，其病原菌为检疫性有害生物L.maculans。两种病菌都以子囊壳和菌 丝在病残株中越夏和越冬，抗逆性强。主要通过空气、病残体和种子传播， 病残体和带菌种子是远距离传播的主要方式。目前，在全球变暖的大气候 下，油菜茎基溃疡病还在欧洲、美洲、澳洲等地蔓延，给油菜产业带来巨 大的损失。中国是世界最大的油菜生产国家，种植面积达700多万公顷， 年产量1000万吨以上。且国内的油菜种植品种对油菜茎基溃疡病缺乏抗 病性，油菜产区气候与国外该病流行地区相似。如果油菜茎基溃疡病菌传 入我国，将会给我国的油菜生产带来毁灭性的打击。2009年8月以来， 上海口岸已经从澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境的多批次油菜籽中截 获油菜茎基溃疡病菌和油菜黑胫病菌。各地检疫部门应加强防范意识，积 极有效的开展进境油菜籽的检疫。有关部门可采取预防措施进行监测和防 控，此外，积极开展我国油菜和十字花科植物的抗性资源筛选，培育抗病 品种，以应对生物安全隐患，保护我国油菜生产安全。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种油菜茎基溃疡病菌的PCR检 测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一方面，提供一种油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法， 包括如下步骤：

(1)设计引物，该引物的序列为：

Lmb3：5’-caccaattggatccccta-3’(SEQ ID NO.1)或其互补链；

Lmb4：5’-aggcgagtcccaagtggaaca-3’(SEQ ID NO.2)或其互补链；

(2)收集菌丝并提取DNA；

(3)采用步骤(1)设计的引物分别进行PCR检测。

步骤(2)中，所述收集菌丝并提取DNA具体为：菌株用PDA培养 基繁殖后收集菌丝，液氮研磨后取菌丝粉，用植物基因组提取试剂盒提取 DNA。