[发明专利]重组葡萄球菌蛋白A基因、含有该基因的表达载体及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种重排的基因，尤其涉及重组葡萄球菌蛋白A基因，本发明还涉及含有该基因的表达载体以及工程菌株，本发明进一步涉及它们在制备葡萄球菌蛋白A中的用途，属于葡萄球菌蛋白A基因工程领域。

背景技术

葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A，SPA)是从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁分离的一种蛋白质。葡萄球菌是革兰氏阳性菌，是最常见的化脓性球菌，为医院交叉感染的重要来源。菌体直径约0.8mm，小球形，常堆聚成葡萄串状，但在液体培养基的前期培养中，常常分散，菌细胞单独存在。早在1940年，Verwey发现在某些金黄色葡萄球菌中含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。1959年Jensen发现此物质可与免疫球蛋白(主要为1gG)结合，并将其命名为A抗原。1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。1964年，Grov将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或A蛋白(proteinA)。SPA为单链多肽，由于其结构中不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。SPA全长为1503bp，其核酸序列、氨基酸序列见SEQID NO3，SEQ ID NO4，主要分三部分：第一部分是从N-端起的36个氨基酸残基构成的信号肽序列S(在蛋白质转运后被切除)；第二部分是五个高度同源的IgG结合结构域E、D、A、B、C，每个结构域约58个氨基酸残基组成，为反3a螺旋束结构；第三部分是C-末端的X蛋白，是与细胞壁结合的成分，不具有IgG结合活性。SPA粘度高于球蛋白，等电点为pH 5.1，其天然结构十分稳定，在6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正恢复原有结构。

葡萄球菌蛋白A具有和很多种属的哺乳动物IgG的Fc端结合的能力，所以在发现之初就受到关注，经过多年的发展，蛋白A已经成为一种应用广泛的免疫学试剂于抗体纯化和免疫学的相关研究中。蛋白A占葡萄球菌菌体蛋白的1.7％，且葡萄球菌为致病菌，所以利用传统的方法从葡萄球菌中提取蛋白A有一定的难度，已经无法满足日益发展的生物产业，所以近些年来利用基因重组技术对蛋白A的重组原核表达技术也逐渐发展起来，期望以更简单的方法获得活性，稳定性更好的产品。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种重组葡萄球菌蛋白A基因，该基因可以在原核表达系统中稳定、高效的表达重组葡萄球菌蛋白A；

本发明目的之二是提供含有上述重组葡萄球菌蛋白A基因的表达载体；

本发明目的之三是提供由上述重组葡萄球菌蛋白A基因所转化的工程菌株；

本发明目的之四是提供一种制备重组葡萄球菌蛋白A的方法；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种重组葡萄球菌蛋白A基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

本发明的重组葡萄球菌蛋白A基因是以SUMO标签和葡萄球菌蛋白A抗体结合区域(SEQ ID NO：3)连接而成。SUMO标签为pSUMO载体上自带标签，构建时在葡萄球菌蛋白A抗体结合区域序列两端添加酶切位点BsaI和BamHI用于与载体相连，并在下游添加终止密码子TAA，上下游的序列分别为：

上游GGTCTCAAGGTAATGCTGCGCAACACG

下游CGCGGATCCTTAAGCATCGTTTAGCTTTTT。

本发明的重组葡萄球菌蛋白A基因的结构由6个His、SUMO标签、蛋白A抗体结合功能区串联而成，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；其中，葡萄球菌蛋白A基因的序列为SEQ ID NO.3所示，所编码的氨基酸序列由SEQ IDNO.4所示(由1185个核苷酸构成编码395个氨基酸)。

本发明还构建林含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及由该重组表达质粒的工程菌株。

本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为一个参考的实施方案，例如，可以将葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因(SEQ ID NO：3)与大肠杆菌表达载体pSUMO利用酶切位点BsaI和BamHI相连，命名为p-SUMO-SPA。