[发明专利]松针红斑病PCR检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种松针红斑病PCR检测方法，属于农林业生物技术领域。

背景技术：

松针红斑病也称松穴褥盘孢菌(Dothistroma)枯针病，是世界流行病害，在中国属重要的森林检疫病害。其病原菌最初来自美洲。目前松针红斑病已被当成南半球及一些国家人工林中最具危害的病害。美国1964年首次报道这种真菌导致过早落叶造成其东部大平原黄松栽植失败，经济损失重大。据报道该病害在加拿大、新西兰、智利、英国、肯尼亚、坦桑尼亚和乌干达等45个国家使60多个松树种、变种和杂交种受害。该病害导致受害树木生长迟缓，发病严重可致树木死亡。

我国1980年首次在东北林业大学凉水实验林场中的樟子松幼苗、人工幼林和天然林中发现该病害。被感染的松树主要有樟子松、红松、赤松、偃松及红皮云杉等。据调查黑龙江省大、小兴安岭地区、内蒙古，吉林及云南等地都有过发生的报道，严重地区发病率达100％。松针红斑病菌的寄主范围广、适生范围大、危害严重、难以根除、易于人为传播，是危险性很大的林业检疫有害生物，并且有扩散蔓延趋势，对我国的松树资源构成很大的威胁。

该病害的国内外一直采用传统的形态与危害症状的鉴定，但该病害的发生由于地域广，受环境因素的影响该病原菌的形态变化比较大，危害症状出现比较慢，造成早期鉴定困难。

核糖体基因转录间隔区ITS是由Gonzalea1990年提出后逐步发展起来的全新的分子标记检测技术，ITS区段既具保守性，又在科、属、种水平上均有特异性序列，通过对ITS区设计特异性引物，来诊断和检测植物病原菌，尤其是对植物病原真菌的分子检测已越来越被广泛应用。2003年杨佩文等应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4，对十字花科蔬菜根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)rDNA进行PCR扩增，测序分析和特异引物的设计，获得根肿菌一特异性分子片段并对不同寄主植物进行了检测。张薇等对分离自 苏南丘陵地区的苜蓿菌核病菌株NJ1的rDNA，利用ITS区段通用引物ITS4和ITS5进行PCR，经同源性比较，并结合病原菌致病性测定和形态学特征观察，将发病症状较相似、形态学上不容易区分且均能够侵染豆科植物造成菌核病的S.trifoliorum，S.sclerotiorum和S.minor 3种病原菌区分开，，并将其鉴定为三叶草核盘菌(Sclerolinia trifoliorum)。由于这种方法快速、准确和简便，已成为研究病原真菌系统进化和病害诊断的强有力辅助工具，也越来越受到植物病理学家们的重视。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术中松针红斑病生物学检测所需要周期长，一般需要30-50天，早期鉴定困难的问题，提供一种松针红斑病的PCR检测方法，对松针红斑病进行PCR扩增检测，该方法用时短、准确率高、灵敏性高。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

松针红斑病PCR检测方法，该方法包括如下步骤：取1μL松针红斑病DNA溶液，加入反应液Taq聚合酶1μL、10×PCR Buffer5μL、dNTP 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL、无菌去离子水36.25μL进行PCR扩增反应；然后取8μLPCR扩增产物，在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果：如果存在分子量约为180bp的DNA条带，则证明所检病原为松针红斑病病原菌。

所述的松针红斑病PCR检测方法，所述的Taq聚合酶的浓度为5U/μL，所述的10×PCR Buffer中Tris-HCL为100mM，KCL为500mM，MgCL2为15mM，dNTP为2.5mM，上游引物为20μM，下游引物为20μM，所述的上游引物序列为5’CGACCTCCAACCCTT 3’，所述的下游引物序列为5’CGCTGCGTTCTTCAT 3’。

所述的松针红斑病PCR检测方法，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min；29个循环，最后72℃延伸7min。

本发明的有益效果：