[发明专利]新的果糖基肽氧化酶

说明书

技术领域

本发明涉及具有果糖基肽氧化酶活性的新蛋白、编码所述蛋白的DNA、用于生产所述蛋白的方法、使用所述蛋白测量糖化蛋白的方法以及包含所述蛋白的用于测量糖化蛋白的试剂。 

背景技术

糖化蛋白包含在生物样品例如体液和毛发中，体液包括血液等。血液中存在的糖化蛋白的浓度取决于溶解在血清中的糖、例如葡萄糖的浓度，并且最近，在临床诊断领域中，测量血液中的糖化蛋白——血红蛋白A1c的浓度(非专利文献1)，被用于诊断和监测糖尿病。作为测量这种血红蛋白A1c的方法，已经知道的有使用高效液相色谱(HPLC)的仪器分析方法(非专利文献2)、使用抗原-抗体反应的免疫分析法(例如非专利文献3)等，但是在近年中，已经开发了酶分析法，例如，已经开发了使用蛋白酶和果糖基肽氧化酶的方法(专利文献1)。酶分析法能够适用于通用自动化分析仪，并且因为操作也简单，它们的开发越来越多。 

在酶分析法中使用的果糖基肽氧化酶，是一种催化在分子氧的存在下通过氧化切开酮糖衍生物中的C-N键而产生邻酮醛糖(α-酮基醛)、肽和过氧化氢的反应的酶，所述酮糖衍生物由葡萄糖的半缩醛与肽的N-端氨基之间的反应产生的葡萄糖胺的Amadori重排所产生。 

在如图1中所示的酶分析法的情形中，一种方法是已知的，其中首先用蛋白酶降解血红蛋白A1c，并从血红蛋白的β-链的N-端产生α-果糖基缬氨酰组氨酸(在后文中称为α-FVH)；接下来，使果糖基肽氧化酶作用于所产生的α-FVH，将产生的过氧化氢在过氧化物酶存在 下应用于氧化缩合以产生醌色素，并且使用分光光度计通过比色法测定产生的量(专利文献1)。 

然而，作为蛋白酶处理的副产物，形成了ε-果糖基赖氨酸和含有它的糖化肽，并且已经指出，当果糖基肽氧化酶作用于它们时，存在着血红蛋白A1c的测量值可能高于真实值的风险(专利文献2)。 

已经从细菌、真菌和植物发现果糖基肽氧化酶。例如源自于Achaetomiella属、毛壳属(Chaetomium)(专利文献3)、弯孢霉属(Curvularia)(专利文献2)、蔷薇科(Rosaceae)、葡萄科(Vitaceae)、伞形科(Apiaceae)(专利文献4)、姜科(Zingiberaceae)(专利文献5)等的果糖基肽氧化酶是已知的。 

然而，到目前为止报道的果糖基肽氧化酶具有缺点，例如： 

(1)针对α-糖化二肽(α-果糖基缬氨酰组氨酸)的活性与针对α-糖化氨基酸(例如α-果糖基缬氨酸)的活性相比不一定高； 

(2)如上所述，除了N-端α-糖化二肽之外，它也作用于其中糖连接到赖氨酸的ε-氨基上的ε-糖化氨基酸(ε-果糖基赖氨酸)，并增加血红蛋白A1c测量中的测量值；以及 

(3)在使用酶的测量方法的情形中，酶在测量或储存过程中变得不稳定。 

为了克服这些缺点，已经报道了由于在果糖基肽氧化酶中人工导入突变而对ε-果糖基赖氨酸的反应性降低的酶(专利文献4)、也是由于导入突变而耐热性增加的酶(非专利文献4)等。然而，以高水平同时克服上面提到的(1)至(3)的缺点的酶的存在，仍是未知的。 

非专利文献1：Clinical Chemistry and Laboratory Medicine第36卷，p.299-308(1998). 

非专利文献2：Chromatogr.Sci.，第10卷，p.659(1979). 

非专利文献3：日本临床检查自动化学会杂志，第18卷，第4号，p.620(1993). 

非专利文献4：Appl.Microbiol.Biotechnol.，第78卷，第5号，p.775-781(2008). 

专利文献1：特开2001-95598号公报。 

专利文献2：国际公布WO 2004/104203号单行本。 

专利文献3：特开2003-235585号公报. 

专利文献4：国际公布WO 2004/038033号单行本。 

专利文献5：国际公布WO 2004/038034号单行本。 

发明内容

[本发明待解决的问题]