[发明专利]产生嘌呤核糖核苷和核糖核苷酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工业，且具体涉及产生嘌呤核糖核苷的方法，其作为嘌呤核苷酸合成中的原材料是重要的。所述方法使用经修饰而弱化编码3-己酮糖-6-磷酸的基因的表达的芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。

背景技术

已知使用腺嘌呤营养缺陷型菌株发酵产生嘌呤核苷的方法。而且，这些菌株可被进一步赋予针对多种药物如嘌呤类似物和磺胺胍(sulfaguanidine)的抗性。这些菌株的实例包括多种芽孢杆菌属菌株(日本专利公开号38-23039(1963)、54-17033(1979)、55-2956(1980)和55-45199(1980)，日本专利申请公开号56-162998(1981)、日本专利公开号57-14160(1982)和57-41915(1982)，以及日本专利申请公开号59-42895(1984))，短杆菌属(Brevibacterium)菌株(日本专利公开号51-5075(1976)和58-17592(1972)，以及Agric.Biol.Chem.，42，399(1978))，埃希氏菌属(Escherichia)菌株(WO9903988)等。

获得上述突变体菌株常规地是通过对微生物通过UV辐射或通过用亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理进行诱变，并通过使用合适的选择培养基来选择具有所需特征的菌株而实现的。或者，突变体菌株已通过使用遗传工程技术进行培育而获得，例如对于芽孢杆菌属的菌株(日本专利申请公开号58-158197(1983)、58-175493(1983)、59-28470(1984)、60-156388(1985)、1-27477(1989)、1-174385(1989)、3-58787(1991)、3-164185(1991)、5-84067(1993)和5-192164(1993)号，美国专利7,326,546(2008))和短杆菌属的菌株(日本专利申请公开号63-248394(1988))。这些产生肌苷的菌株的生产力(productivity)可进一步通过增加它们分泌肌苷酸的能力来改进(俄罗斯专利申请号2002101666、2002104463和2002104464)。

核酮糖单磷酸(RuMP)途径是用于从一碳单位合成含碳碳键化合物的代谢途径之一，并存在于许多利用甲醇和甲醛，称作甲基营养菌(methylotroph)的细菌中。该途径的特征性酶是3-己酮糖-6-磷酸合酶(3-hexulose-6-phosphatesynthase，HPS)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(6-phospho-3-hexuloisomerase，PIH)，人们认为两者皆不存在于非甲基营养菌之外。然而，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的假定的yckG基因产物(YckG)具有类似于甲基营养菌HPS相应基因产物的一级结构。也研究了yckF基因产物(YckF)与甲基营养菌PHI之间的序列相似性，并发现枯草芽孢杆菌的yckG和yckF基因分别表达具有HPS和PHI酶活性的蛋白质。在枯草芽孢杆菌中，用甲醛可相伴地诱导这两种活性，显示对yckH基因的依赖性，但用甲醇、甲酸或甲胺并无法对其进行诱导。破坏两个基因任一导致对甲醛的中等敏感性，表明这些酶可在枯草芽孢杆菌中作为对甲醛的解毒系统起作用。在非甲基营养菌枯草芽孢杆菌中发现了活性的yckG(对于HPS)-yckF(对于PHI)基因结构，其固有地保存了RuMP途径(Yasueda，H.等，J.Bacteriology，181(23)，p.7154-7160(1999))。

然而，先前并未报道为了改善嘌呤核糖核苷生产力的目的使编码3-己酮糖-6-磷酸合酶的基因失活。

发明内容

本发明的一个方面是改善适于通过发酵产生嘌呤核苷的微生物，并提供使用所述微生物的菌株产生嘌呤核苷的方法。

该目标是通过发现弱化编码3-己酮糖-6-磷酸合酶的基因的表达可增强嘌呤核苷如肌苷、黄苷、鸟苷或腺苷的产生而实现的。

本发明提供了具有增加的产生嘌呤核苷的能力的属于芽孢杆菌属的细菌，特别是，提供了枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

本发明的一个方面是提供能够产生嘌呤核苷的芽孢杆菌属细菌，其中所述细菌经修饰而减少了3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)活性。

本发明的另一个方面是提供能够产生嘌呤核苷的细菌，其中所述细菌经修饰而弱化了编码3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)的基因的表达。