[发明专利]利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法

说明书

技术领域

该发明涉及松脂醇二葡萄糖苷的制备方法，具体是一种利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法。 

背景技术

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是中国传统的名贵中药，其降血压功能持续、稳定、无副作用，是其他化学降压药无法比拟的。已有研究证明，杜仲中主要降压成分是松脂醇二葡萄糖苷(PDG)。获取杜仲中功能性成分的传统方法是利用杜仲的皮、叶进行提取。这种方法受到材料来源的限制，无法满足市场需求，而且会破坏杜仲资源，不利于可持续发展。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种从杜仲中分离一株内生菌，再经过微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法。与传统方法相比，用微生物发酵法生产植物有效成分具有简便、快速、成本低等特点。 

从杜仲中分离到的一株内生菌为拟茎点菌属XP-8(Phomopsis sp.XP-8)，于2009年12月1日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M209291。 

内生菌XP-8的制备方法如下： 

(1)取新鲜的杜仲树皮，切成约0.5cm×0.5cm大小的小块，先在70％酒精中浸泡1min，然后用3％次氯酸钠(有效氯)溶液处理2min，无菌水清洗两次，接种于PDA培养基平板上，25℃下培养； 

(2)培养3-5d，待平板上菌丝萌发时，用划线或稀释等分离方法，挑取形态不同的菌落，转入到PDA斜面培养基上，在25℃条件下培养。经过分离、筛选、纯化的反复过程，直至得到纯化的典型菌落； 

(3)纯化后的菌种移至PDA培养基的斜面上培养后，4℃保存。 

一种利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法包括以下步骤： 

(1)液体种子的制备：取2cm²活化好的内生菌XP-8菌种接入种子培养基中，装液量为100ml/250ml三角瓶，在28℃，180r/min条件下摇床培养120h； 

(2)液体发酵：以10％(V/V)的接种量将上述培养好的液体种子接入发酵培养基中，发酵培养基在发酵罐中的装量为发酵罐体积的40％～70％，控制发酵罐的搅拌转速为160～180r/min，发酵液温度控制为28℃，培养168～240h； 

(3)产物的分离：发酵结束后，取发酵液，在5000r/min下离心10min；取上清液，加入2倍于发酵液体积的95％乙醇溶液，静置24h；然后在5000r/min下离心10min；取上清液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下减压浓缩10～20倍，高速离心13000r/min，10min，取上清液； 

(4)产物的提取：选用树脂S-8对(3)中所得上清液进行吸附，吸附时，发酵液中松脂醇二葡萄糖苷的浓度为0.195mg/ml，温度为20℃，pH值为9，控制流速1BV/h，溶液处理量20BV；然后，再用洗脱液进行洗脱，洗脱条件是：以30％的乙醇水溶液为洗脱液，控制洗脱液流速1BV/h，洗脱液用量为6BV；收集全部洗脱液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下蒸发出所有乙醇，所得液体即为松脂醇二葡萄糖苷的粗提液，整个纯化过程对发酵液中松脂二葡萄糖苷的收集率为89.8％； 

(5)产物的纯化：将(4)中所得松脂醇二葡萄糖苷粗提液用孔径为0.45μm的水性醋酸纤维微孔滤膜过滤，取滤液在制备液相色谱仪上进行纯化，收集出峰时间在4.46-4.47min处的组分，即为松脂醇二葡萄糖苷溶液。蒸发挥干溶液中溶剂，所得粉末，即为松脂醇二葡萄糖苷的纯品； 

上述制备过程中，所用培养基分别为： 

内生菌XP-8菌种保藏培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，自然p H(约7.2)； 

种子培养基：采用察氏培养基，组成为蔗糖30.0g，NaNO₃ 2.0g，K₂HPO₄1.0g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然p H(约7.89)；