[发明专利]利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法

权利要求书

1.内生菌XP-8，中国典型微生物保藏中心保藏，编号为CCTCC M209291。

2.如权利要求1所述的内生菌XP-8，其特征在于：其制备方法如下：

(1)取新鲜的杜仲树皮，切成约0.5cm×0.5cm大小的小块，先在70％酒精中浸泡1min，然后用3％次氯酸钠(有效氯)溶液处理2min，无菌水清洗两次，接种于PDA培养基平板上，25℃下培养；

(2)培养3-5d，待平板上菌丝萌发时，用划线或稀释等分离方法，挑取形态不同的菌落，转入到PDA斜面培养基上，在25℃条件下培养。经过分离、筛选、纯化的反复过程，直至得到纯化的典型菌落；

(3)纯化后的菌种移至PDA培养基的斜面上培养后，4℃保存。

3.一种利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

(1)液体种子的制备：取2cm²活化好的内生菌XP-8菌种接入种子培养基中，装液量为100ml/250ml三角瓶，在28℃、180r/min条件下摇床培养120h；

(2)液体发酵：以10％(V/V)的接种量将上述培养好的液体种子接入发酵培养基中，发酵培养基在发酵罐中的装量为发酵罐体积的40％～70％，控制发酵罐的搅拌转速为160～180r/min，发酵液温度控制为28℃，培养168～240h；

(3)产物的分离：发酵结束后，取发酵液，在5000r/min下离心10min；取上清液，加入2倍于发酵液体积的95％乙醇溶液，静置24h；然后在5000r/min下离心10min；取上清液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下减压浓缩10～20倍，高速离心13000r/min，10min，取上清液；

(4)产物的提取：选用树脂S-8对(3)中所得上清液进行吸附，吸附时，发酵液中松脂醇二葡萄糖苷的浓度为0.195mg/ml，温度为20℃，pH值为9，控制流速1BV/h，溶液处理量20BV；然后，再用洗脱液进行洗脱，洗脱条件是：以30％的乙醇水溶液为洗脱液，控制洗脱液流速1BV/h，洗脱液用量为6BV；收集全部洗脱液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下蒸发出所有乙醇，所得液体即为松脂醇二葡萄糖苷的粗提液，整个纯化过程对发酵液中松脂二葡萄糖苷的收集率为89.8％；

(5)产物的纯化：将(4)中所得松脂醇二葡萄糖苷粗提液用孔径为0.45μm的水性醋酸纤维微孔滤膜过滤，取滤液在制备液相色谱仪上进行纯化，收集出峰时间在4.46-4.47min处的组分，即为松脂醇二葡萄糖苷溶液。蒸发挥干溶液中溶剂，所得粉末，即为松脂醇二葡萄糖苷的纯品；

上述制备过程中，所用培养基分别为：

内生菌XP-8菌种保藏培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，自然p H(约7.2)；

种子培养基：采用察氏培养基，组成为蔗糖30.0g，NaNO₃2.0g，K₂HPO₄1.0g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然pH(约7.89)；

发酵培养基：蔗糖47.5g，NaNO₃3.0g，K₂HPO₄2.83g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然pH(约7.89)；

上述制备过程中，产物纯化所用制备液相色谱纯化的条件为：检测波长228nm，柱温25℃，流动相的流速为12ml/min，进样量4ml/次，流动相为32％甲醇水溶液。

4.如权利要求3所述的一种利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述松脂醇二葡萄糖苷应用于医药和食品加工以及化学分析与检测等领域。