[发明专利]检测苹果边腐病菌的引物和探针及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及苹果边腐病菌检测用引 物和探针及其检测方法。

背景技术

苹果边腐病菌(Phialophora malorum)是苹果和梨上的一种重要 的病害，该病菌曾对美国西北部储藏期的苹果和梨引致严重的损失， 经济影响很大。目前病菌分布在美国、英国、加拿大、荷兰、意大利 等，中国无分布，为我国新颁布的检疫性有害生物。P.malorum的寄 主植物主要有苹果、梨和芦笋，对苹果和梨的侵害主要发生在储藏期， 引起果实腐烂，在荷兰还有侵染芦笋的记载。病菌通过罹病果实、苗 木和土壤进行传播扩散，一旦传入我国，将会对我国水果产业带来严 重威胁。

本发明应用实时荧光PCR对苹果边腐病菌的分子检测方法进行 研究，通过ITS序列设计一条荧光标记探针和一对引物，建立了对苹 果边腐病菌稳定、高效的检测方法，可根据扩增曲线判定是否有苹果 边腐病菌。

发明内容

本发明目的在于提供一种苹果边腐病菌检测用引物及一种苹果 边腐病菌检测用探针。

本发明另一目的在于提供一种苹果边腐病菌的检测方法。

根据发明目的，本发明提供一种苹果边腐病菌检测用引物，其核 苷酸序列为：

PMA-P1：5’-ATAACCACTCAAGCTCTCG-3’

PMA-P2：5’-GTTGCTGGCAAGTAGACTAC-3’。

本发明还提供一种含有前述引物的试剂盒。

本发明还提供一种与前述引物配合使用的探针，其核苷酸序列 为：5’-FAM-TTCGCGGTTCCGCAGGCC-TAMRA-3’，该探针一端标 记有报告荧光染料，另一端采用了荧光性的淬灭基团。

前述的探针，其5’端标记有FAM荧光染料，3’端采用了荧光性 的淬灭基团TAMRA。可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物 序列设计其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。

本发明还提供一种含有前述引物及探针的试剂盒。

本发明另外提供一种检测苹果边腐病菌的方法，其是以样品总 DNA为模板，利用前述的引物及探针进行实时荧光PCR扩增，每个 循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

前述的方法，其中实时荧光PCR的反应过程中的退火和延伸温 度为56℃。

本发明通过分析已报道苹果边腐病菌ITS序列的基础上，分别设 计引物和荧光探针。根据P.malorum的内转录间隔区(ITS)设计特 异引物和TaqMan探针，能够快速、准确地对P.malorum进行定性检 测，同时也可检测感染了P.malorum的苹果和梨。目前国内外对于 P.malorum的识别仅限于形态上，未见分子检测方法的研究。

普通Taqman探针技术，即将报告荧光染料标记在探针的5’端， 而3’端采用了荧光性的淬灭基因，当探针完整的时候，报告基团所发 射的荧光能量被淬灭基因吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进 行，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将与 模板结合的探针切断，淬灭基团的抑制作用消失，报告荧光染料产生 荧光信号，从而实现对苹果边腐病菌的检测。

实时荧光PCR的25μL反应体系：样品DNA 1μL(0.005-0.5ng)， 10X PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL，25mM MgCL₂ 2μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM引物PMA-P1 1μL，10μM引物PMA-P2 1μL，10μM探 针1.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，ddH₂O 12.7μL。

反应条件：第一个循环为95℃10min；随后40个循环，95℃15s、 56℃1min。

本发明根据苹果边腐病菌ITS序列设计的引物及探针，该探针特 异性好，用于荧光PCR检测灵敏性高。此外，本发明建立了适合口 岸应用的简便的检测方法，即直接从进境的水果果实上检测边腐病 菌，操作快捷、结果准确，避免了用传统的分离和培养病菌方法所产 生的耗费时间和易疏漏的缺陷，顺应了当今检验检疫工作的特点，为 进出口安全提供了保证。

附图说明