[发明专利]一种基于双核微核的DNA修复能力检测方法

权利要求书

1.一种基于双核微核的DNA修复能力检测方法，其特征在于，以双核微核为观察终点，以博莱霉素诱导淋巴细胞DNA染色体损伤，用胞质分裂阻滞微核试验与DNA修复酶抑制剂3-氨基苯甲酰胺结合，测定修复后剩余的DNA损伤，通过下式分别计算微核率和3AB指数，检测、评价DNA损伤后修复能力；

微核率＝微核数/观察细胞数×1000‰；

3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。

2.按权利要求1所述的DNA修复能力检测方法，，其特征在于，包括下述步骤：

1)胞质分裂阻滞微核试验

建立胞质分裂阻滞微核试验技术；

2)博莱霉素试验浓度和3-AB试验浓度的确定

选取受试对象外周血淋巴细胞，采用不同浓度博莱霉素和不同浓度的3-AB来进行该试验，每次试验均进行平行试验，根据细胞活力和每1000个淋巴细胞中的微核数确定博莱霉素浓度和3-AB浓度；

3)淋巴细胞培养；

4)淋巴细胞收获与制片；

5)镜检阅片与DNA修复能力的检测。

3.按权利要求2所述方法，其特征在于，其中步骤2)的博莱霉素浓度和3-AB浓度，分别为1ug/ml和1.25mmol/L。

4.按权利要求2所述的方法，其特征在于，通过下述步骤培养所述的淋巴细胞：

在15ml的刻度离心管中加入组合培养液，每管4.5ml，PHA 0.2ml/管，最后加0.5ml抗凝血，每份样品均做平行培养，37℃培养24h，加入BLM(BLM应用液加入50ul为3ug/ml，加入16.67ul为1ug/ml)，37℃培养30min，之后用5ml的培养基(含10％胎牛血清)1000g离心10min洗两次，之后一份继续培养，另一份加入3-AB(本次采用1.25mmol/L即在5ml体系中加入31.25ul)继续培养。20h后加细胞松弛素B应用液100μl，终浓度6μg/ml，继续培养28h收获。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的BLM应用液加入50ul为3ug/ml，加入16.67ul为1ug/ml；所述的的5ml的培养基中含10％胎牛血清。

6.按权利要求2所述方法，其特征在于，其中淋巴细胞收获与制片通过下述步骤：

a.培养结束后离心1000g/min 10min，弃上清液；

b.低渗：将3ml 0.075M KCl 37℃加入离心管，混匀1-5min；

c.加固定液4ml，混匀，预固定；

d.离心10min，弃上清液；e.加固定液5ml，混匀，室温固定30min，离心，弃固定液；f.重复步骤e，加0.3-0.5ml固定液混匀；

h.滴片：将玻片从冰水中取出，滴片，自然干燥，过夜后再染色；

i.10％Giemsa染色10min，镜检分析。

7.按权利要求6所述方法，其特征在于，所属的步骤c)的固定液中，甲醇∶冰醋酸为3∶1。

8.按权利要求2所述方法，其特征在于，通过下述步骤检测所述的DNA修复能力：

低倍镜下寻找细胞分散均匀的视野，转油镜或计算机图像转换分析系统下观察；选择胞浆完整的双核淋巴细胞，微核位于细胞质中，与细胞核相切或完全分开，边缘光滑，嗜色性与细胞核完全一致，大小为主核的1/3以下，不与主核接触；计数1000个双核淋巴细胞中含一个、两个或多于两个微核的细胞数，计算双核微核细胞率；以微核率和3AB指数作为分析指标；所述微核率＝微核数/观察细胞数×1000‰；所述3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。