[发明专利]一种增强型毕赤酵母AOX1启动子

说明书

技术领域

本发明涉及基因表达调控技术领域，更具体地，涉及真核基因表达调控技术领域， 特别是指一种增强型毕赤酵母AOX1启动子。

背景技术

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近年来使用非常广泛的一种酵母表达系统。 在毕赤酵母中存在两个编码醇氧化酶的基因：AOX1和AOX2。在甲醇诱导的条件下， AOX1蛋白能占细胞总蛋白的30％，AOX1的mRNA占总mRNA的5％。因此，目前在毕 赤酵母表达系统中，驱动外源基因表达的启动子一般采用AOX1启动子。为了提高外 源基因在毕赤酵母中的表达，一般的做法是通过G418、Zeocin等选择压力提高外源基 因在重组毕赤酵母染色体上整合的拷贝数。在相同拷贝数的情况下，极少有通过改变 AOX1启动子的序列来提高外源基因表达的报道。2008年，Hartner等人通过构建启动 子突变文库，在AOX1基因启动子上缺失-771至-712位碱基并形成两拷贝-203至-190位 碱基序列时，报告基因GFP的表达量上升至160％(Nucleic Acids Res.36：e76)。

因此，本发明人尝试构建增强型毕赤酵母AOX1启动子，以期提高外源基因在毕 赤酵母中的表达，从而提高表达效率。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种增强型毕赤酵母 AOX1启动子，该增强型毕赤酵母AOX1启动子能使其后插入的外源基因在毕赤酵母 中高效表达，从而提高了表达效率，适于表达载体的构建。

为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种增强型毕赤酵母AOX1启 动子，其特点是，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子包括由2-9个拷贝的SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列串联的核苷酸片段和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述核苷酸 片段连接在所述的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5’端。

较佳地，所述的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的拷贝数为3、2或9。

在本发明的第二方面，提供了一种增强型毕赤酵母AOX1启动子，其特点是，所 述增强型毕赤酵母AOX1启动子与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有80％以上的同 源性。

较佳地，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子为所述的SEQ ID NO：3所示的核苷酸 序列。

较佳地，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子为所述的SEQ ID NO：6所示的核苷酸 序列。

较佳地，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子为所述的SEQ ID NO：7所示的核苷酸 序列。

较佳地，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子为所述的SEQ ID NO：8所示的核苷酸 序列。

本发明的有益效果如下：

1)本发明的一种增强型毕赤酵母AOX1启动子包括由2-9个拷贝的SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列串联的核苷酸片段和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所 述核苷酸片段连接在所述的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5’端，应用该启 动子驱动外源基因表达时，和天然AOX1启动子相比，可使外源基因mRNA 转录平均增加25％-35％，使外源基因蛋白表达量平均增加45％-60％，可使外 源基因在毕赤酵母中表达更高效，适用于表达载体的构建；

2)本发明的另一种增强型毕赤酵母AOX1启动子与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序 列具有80％以上的同源性，采用该增强型毕赤酵母AOX1启动子驱动外源基因 表达时，和天然AOX1启动子相比，可使外源基因mRNA转录平均增加15％～ 20％，使外源基因蛋白表达量平均增加25％～37％，可使外源基因在毕赤酵母 中表达更高效，适用于表达载体的构建。

附图说明

图1是本发明的菌株R3表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的 GFP毕赤酵母菌株作为对照。

图2是本发明的菌株R2表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的 GFP毕赤酵母菌株作为对照。

图3是本发明的菌株R9表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的 GFP毕赤酵母菌株作为对照。

图4是本发明的菌株M1表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的 GFP毕赤酵母菌株作为对照。