本发明涉及高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)SEQ ID NO:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。本发明还提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)编码下式所示的多肽序列的多核苷酸序列：A‑L1‑B‑L2‑RML；式中，A可存在或不存在，当存在时，为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L1在A存在时存在，为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；B为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L2为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；RML表示米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。
本发明提供了一种具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白。所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：12所示序列相比存在以下突变中的至少1个：L86I，G187D，E209K和A245D。本发明的蛋白不仅可以作为磷脂酶和/或溶血磷脂酶，而且，还可以用于同时需要磷脂酶和溶血磷脂酶的应用，例如，可以应用于L‑α‑甘油磷酸胆碱的制备。
本发明提供一种磷脂酶C突变体。具体而言，本发明提供一种分离的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有：(1)SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；或(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：8所具备的磷脂酶C活性的由(1)衍生的多肽。本发明也涉及所述氨基酸序列的编码序列、核酸构建体、宿主细胞以及相应的用途。
本发明提供一种高酯化活力的脂肪酶突变体。具体而言，本发明提供一种多肽，所述多肽选自：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的多肽；和(2)由SEQ ID NO：7所示的序列与促进SEQ ID NO：7所示的序列表达与纯化的序列组成的多肽。本发明还提供编码该多肽的多核苷酸序列，相应的核酸构建物、宿主细胞，以及本发明多肽、多核苷酸序列、核酸构建物和宿主细胞在制备生物柴油中的应用。
本发明提供了一种具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白。本发明提供的蛋白具有与SEQ ID NO：3、4、5、6或19所示序列，或与SEQ ID NO：3、4、5、6或19所示序列具有至少90％同源性，且所述蛋白源自黑曲霉。本发明的蛋白不仅可以作为磷脂酶和/或溶血磷脂酶，而且，还可以用于同时需要磷脂酶和溶血磷脂酶的应用，例如，可以应用于L‑α‑甘油磷酸胆碱的制备。
本申请提供了新的具有脂肪酶活性的多肽，其包含如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列或上述序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列。本申请还提供了编码所述多肽的多核苷酸、含有上述多核苷酸的表达载体和宿主细胞。此外，本申请还涉及上述具有脂肪酶活性的多肽的用途。本文公开的多肽能够在高温及高甲醇浓度下快速地制备脂肪酸甲酯，进而用于生物柴油的制备。
本申请提供了具有磷脂酶C活性的多肽，该多肽具有1)包含在一个或多个位置发生氨基酸取代的SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，其中所述一个或多个位置选自SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位或其任意组合；或2)与1)至少80％序列同一性，且第6位、第8位、第10位、第104位、第205位的至少1个位置与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位不同。本申请还提供了编码所述多肽的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的细胞。本申请还提供了所述多肽、核酸分子载体以及细胞的用途。
