[发明专利]一种现场快速定性定量检测铜绿微囊藻的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种现场快速定性定量检测水华微藻的试剂盒及方法，特别涉及一种用于水华预警预报方面的全细胞荧光原位杂交技术(Whole-cell Fluorescence in situ Hybridization，FISH)检测铜绿微囊藻的方法。

背景技术

荧光原位杂交技术是细胞生物学和分子生物学技术(主要是分子杂交技术)相结合的产物，主要是选择一个已知序列中特异的DNA片段，用荧光标记后作为荧光原位杂交技术的探针与中期细胞的染色体或细胞核的DNA杂交(结合)，在染色体上显示与荧光探针同源的DNA片段的位置，从而将这个已知序列的DNA片段定位在细胞中。荧光原位杂交技术不仅准确、快速、灵敏，而且简单方便，目前已经在细胞遗传学、产前诊断及肿瘤生物学上广泛应用。

目前水华微藻的分类与识别方法主要有三种：(1)根据细胞的形态进行分类。但是，这些产生水华的微藻形态有时很难区分，并且有些形态的细微差别是由于环境条件的不同而产生的，以这些形态上的差别作为分类的标准会造成水华微藻分类上的混乱；同时，以形态上的差异作为分类的依据，分类学家之间有不同的标准，从而给分类带来一定的主观性。(2)采用分子生物学技术。如：序列测定、限制性片段长度多态性RFLP(Restricted Fragment Length Polymorphism)、随机扩增多态性RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)等。应用这些方法均可以有效地鉴定某株藻并通过构建进化树确定该株藻的分类位置。但上述分子生物学方法都有着无法避免的缺点：操作时间长，检测样品少以及不能定性检测自然水体样品等。同时应用分子生物学方法鉴定水华微藻的前提条件是水华微藻必须经过分离纯化以及实验室单种培养。有些水华微藻难以分离，实验室单种培养更为困难，这些因素无疑限制了用分子生物学方法鉴别水华微藻。(3)将在医学领域广泛使用的免疫荧光技术应用到水华微藻检测上。应用免疫荧光技术首先要制备合适的抗体(单抗或多抗)，如果制备的抗体合适，则免疫荧光技术表现出优越性。应用免疫荧光技术不仅灵敏、简单，而且可以对水体中同种水华微藻细胞进行定量，比水华微藻的分子生物学鉴定更为优越。然而，水华微藻抗体的获得基于藻细胞的外部形态特征，藻细胞的外部形态又极易受环境的影响，并且有些水华微囊细胞有共同的胶质鞘，使得抗体与细胞的结合受到阻碍，因而其准确性受到怀疑。同时，在自然水体中某些微生物往往会和水华微藻的抗体发生非特异性免疫交叉反应，在进行自然水体水华微藻细胞定量分析时出现严重偏差。因此，用免疫荧光方法对自然水体中的水华微藻细胞进行定性和定量分析时，可信度并不高。

以上水华微藻鉴定方法具有局限性和对水华微藻鉴定的不准确性，到目前为止，在国内还未检索到水华微藻快速现场检测的报道。

发明内容

本发明提供一种现场快速定性定量检测铜绿微囊藻的试剂盒及方法，目的是解决现有的分子生物学技术检测铜绿微囊藻时需要纯化藻细胞、检测时间长的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：所述试剂盒包括碱基序列如下的核酸探针：

5’-AGCCAATTTCGCCTCGCTCC-3’；

该核酸探针的5’端腺嘌呤(A)添加有异硫氰酸荧光素标记。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：采用下列试剂盒按照检测方法进行检测：

A、试剂盒

(1)核酸探针：

5’-AGCCAATTTCGCCTCGCTCC-3’；

该核酸探针的5’端腺嘌呤(A)添加有异硫氰酸荧光素标记。

(2)固定液：

所述固定液是将多聚甲醛溶于pH7.5的磷酸缓冲液得到，其中多聚甲醛的浓度是每100ml的固定液中含有4g的多聚甲醛；

(3)清洗液：1倍的SSC缓冲液(20倍的SSC缓冲液(pH7.0)稀释而成)；

(4)杂交缓冲液：每100ml杂交缓冲液由20ml20倍的SSC缓冲液(pH7.0)、40ml甲酰胺和40ml双蒸水组成；

B、检测方法

第一步：固定藻细胞

将收集的铜绿微囊藻藻细胞液体采用离心分离的方法得到铜绿微囊藻藻细胞，于冰上用所述固定液将所述铜绿微囊藻藻细胞在培养皿固定完全后，吸去固定液；

第二步：脱水

向固定于培养皿中的铜绿微囊藻藻细胞滴加乙醇溶液，然后吸去乙醇溶液使铜绿微囊藻藻细胞脱水，共进行两次，依次用体积浓度80％乙醇溶液和体积浓度90％的乙醇溶液；

第二步：杂交