[发明专利]鉴别香菇菌种241和241-4的分子特异性标记引物及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种可区别香菇生产近缘种241和241-4的分子特异性标 记引物，以及利用该引物对香菇生产菌种241和241-4进行区别和鉴定的 方法。

(二)背景技术

香菇Lentinula edodes(Berk.)Pegler因其美味和具有重要的食、药用 价值而倍受国内外消费者的喜爱，是我国商业化生产规模最大和世界上产 量仅次于双孢蘑菇的食用菌。中国是最早栽培香菇的国家，目前香菇产量 达到全世界的70％。

香菇菌种是香菇生产中最重要的生产资料，目前在中国商业化栽培使 用的香菇菌种已超过100余种。不同的香菇菌种具有不同的生产性状和商 业利用价值，因而菌种的快速准确鉴定对于香菇产业的发展至关重要。香 菇菌种鉴定的经典方法主要是通过对香菇菌丝、菌落和子实体形态的宏观 现察、生长特性、生理生化反应以及不同菌株间发生的拮抗反应等。这些 方法由于易受环境因素和生理状况的影响，对形态特征上差异较小的菌株 尤其是一些香菇近缘种例如241与241-4，Cr02与Cr04，申香2号、 申香4号与申香6号，939-9与939-6等难以实现快速准确的鉴别。

此外，由于香菇菌种本身具有无性繁殖的遗传特性，使得在菌种市场 上同种异名，异种同名、假种、劣种现象普遍存在，再加上菌种质量的退 化现象，不仅极大地损害了香菇生产者和育种者的利益，也极大地影响了 我国食用菌产业的持续健康发展。因此，建立起一套科学可靠、快速便捷 的香菇菌种鉴定体系，不仅有利于我国香菇种质资源的发掘与利用，更好 地为选育具有我国自主知识产权的优良香菇菌种服务，而且也是规范现阶 段混乱的香菇菌种市场、促进香菇产业持续健康发展的迫切需要。

分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立 与成熟，为发展简便、快速、准确的菌株鉴定技术提供了有效手段。SCAR (特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD 基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一 对18～24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专 一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分 稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可区别香菇生产近缘种241和241-4的分子特 异性标记引物，以及一种利用该引物对香菇生产菌种241和241-4进行快 速辨别的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种鉴别香菇生产菌种241和241-4的分子特异性标记引物，所述引 物序列为：

上游引物：5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物：5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用RAPD标记获 得香菇241和241-4菌种的差异DNA片段，将该片段克隆测序，以得到 DNA序列为基础设计特异性引物。以该引物对对香菇241和241-4菌种 进行PCR扩增，可从241菌种中获得1609bp大小的特异性片段。

本发明还涉及一种利用所述分子特异性标记引物对香菇生产菌种 241和241-4进行快速鉴别的方法，所述方法包括：提取待测香菇菌种基 因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR 扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现1609bp的DNA条带， 则待测菌种为香菇241菌种，若电泳结果未出现1609bp的DNA条带， 则待测菌种为香菇241-4菌种；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′

所述方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反 应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。