[发明专利]一种Y染色体微缺失的基因检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种用于检测Y染 色体微缺失的方法。

背景技术

根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的1997年的研 究报告指出，在发达国家中不育夫妇占已婚育龄夫妇的15％，其中男性不育 又占不育夫妇总数的50％。对于这50％的男性不育症患者，从临床资料统计 来看，可将其不育的病因大体分为以下四类：生精障碍、输精管道梗阻、性 腺器官附属异常、及性功能异常。其中又以精子发生障碍最为常见。引起精 子发生障碍的因素主要包括两个方面：遗传因素和非遗传因素。遗传因素导 致生精障碍而不育的比率约占不育症患者的30％，因此有关原发性无精子症 及严重少精子症的遗传因素日益受到重视。

Tiepolo和Zuffardi在1976年对6个无精子患者在显微镜下发现长臂1 区1带(Yq11.1)远端缺失，因而推测在Yq11区上存在着Y染色体精子生 成基因，提出了与精子生成密切相关的无精子因子区(azoospermia factor region，AZF)的概念。Vogt等人1996年的研究进一步将AZF区分为AZFa、 AZFb和AZFc。Y染色体上AZF的微缺失可以造成生精障碍，导致无精症或 严重少精子症。临床上利用PCR扩增的序列标签位点(STS)技术来检测Y 染色体AZF微缺失，用于诊断因基因缺陷导致的无精症或严重少精子症，检 出率在1％～55％之间不等。由于AZF区的部分缺失的不育男性可以通过“试 管婴儿”技术生育后代，造成男性后代更为严重的Y染色体微缺失及不育， 所以目前男科学要求Y染色体微缺失基因检测作为男性不育的常规检查，特 别是在实行卵细胞浆内单精子注射(ICSI)和其他人工辅助生殖治疗时必须 做该项检查。因此，建立一种简单、稳定的分子遗传学检测方法，对明确男 性不育的病因和采取相应的治疗方案，具有重要的临床价值。

AZF区长度约为7.5Mb，利用STSs对AZF片段微缺失的定位常常需要选 择多个STS位点来检测。多重PCR技术可以在同一个反应体系同时扩增多对 引物(每一个位点扩增需要一对引物)，以达到简单、快速、高通量和经济 地复合扩增多个基因片断的目的，是Y染色体微缺失采用的较好的方法。但 多重PCR技术相对于常规PCR方法技术含量更高。因为多重PCR要求多对引 物在同一个反应条件下复合扩增，每对引物达到最适扩增效率的反应条件不 一致，这就要求对复合扩增反应体系的引物使用浓度、PCR缓冲液的浓度、 镁离子浓度、dNTP浓度、PCR循环数、PCR循环中的各阶段的温度、不同厂 家Taq酶及用量、模板DNA用量等因素进行调整，优化复合扩增反应条件， 达到最大扩增目的片断效率，同时减少非特异扩增的目的(Henegariu O.，et al.1997，BioTechniques 23：504-511)。

现有技术中，这一过程操作繁琐、失败率高，尤其是扩增效率低下导致 目的片断检测不到，以及引物二聚体大量产生干扰结果判断，对临床快速诊 断带来较大麻烦。有的技术要么选择较少的引物对，要么选择添加某种化合 物，以达到降低引物二聚体的目的。这样造成不能完全检测AZF片段微缺失 (中国发明专利申请200410043918.0)，或增加试剂成本(中国发明专利申 请200710074317.X)。这是本领域一个亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种操作简单、高效、通 过一次性扩增多个基因片断用于检测Y染色体微缺失的方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明提供了一种Y染色体微缺失的基因检测方法，该方法包括以下步 骤：

1.提取人外周血基因组DNA

常规煮沸裂解法或柱洗脱法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得预期DNA 产量约4-12ug，作为模板DNA；

2.PCR扩增

采用多重PCR引物设计，多重PCR反应体系包含N对特异扩增Y染色 体AZF片断中STSs位点的嵌合引物对和1对通用引物对；多重PCR反应 在N+1对引物对的参与下，在同一个反应体系中经过变性、退火、延伸循 环扩增目的DNA模板的反应；

3.检测扩增产物

取10ulPCR产物，EB染色，经3％琼脂糖电泳。电泳电压4V/cm，电泳时 间20分钟；