[发明专利]竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种恒温核酸扩增检测方法，特别是一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法。

背景技术

基因检测是指从待检样品内提取DNA或者RNA，然后利用分子生物学方法来判断待检样品是否有基因异常或携带病原微生物。目前，基因检测可用于对病原微生物的病原检测、各种肿瘤的生物学特性判断、以及遗传病的基因异常分析等。在分子生物学水平上来研究样品的核酸结构和分子特征可实现对病原微生物和细胞基因快速而准确的检测，可大大提高检测水平和研究能力。目前，在分子生物学检测方法中，核酸扩增法是最有效的工具之一。

聚合酶链式反应(PCR)方法是至今使用最广泛的核酸扩增方法，它作为一种简便高效的基因扩增技术在病原菌诊断过程中发挥着重大作用。PCR方法尽管操作起来比较简单易行，扩增产物在短时间内能够大量聚集，但是操作过程必须有高精密的温度循环装置，从而使得这种强有力的方法不能在实地广泛应用。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1h左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，及时将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：1、其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2、仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。3.只可以对待见样品进行定性，而无法实现定量，从而限制了该技术的应用范围。为了克服以上这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法，通过荧光探针的设计和竞争性DNA的作用，经过检测反应前后的荧光量，可实现对样品的定量检测，该方法特异性强、灵敏度高、检准率高。

为达到本发明的目的，采用如下技术方案：

本发明的一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速诊断方法，包括如下步骤：

(1)将细胞悬浮于生理盐水中，离心，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞，加入样品预处理液200～500μl，剧烈震荡混匀；

(2)将震荡混匀后的细胞溶液在100℃加热10～20分钟，冰浴10～20分钟，离心，取上清作为模板DNA；

(3)在PCR反应管中加入模板DNA，目标DNA序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为目标DNA；

(4)竞争DNA序列上游序列的扩增，在PCR反应管中加入模板DNA，竞争DNA上游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的上游序列；

(5)竞争DNA序列下游序列的扩展，在PCR反应管中加入模板DNA、竞争DNA序列下游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的下游序列；