[发明专利]竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法

权利要求书

1、一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增的快速检测方法，其特征在于，按如下步骤进行：

(1)将细胞悬浮于生理盐水中，离心，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞，加入样品预处理液200～500μl，剧烈震荡混匀；

(2)将震荡混匀后的细胞溶液在100℃加热10～20分钟，冰浴10～20分钟，离心，取上清作为模板DNA；

(3)在PCR反应管中加入模板DNA，目标DNA序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为目标DNA；

(4)竞争DNA序列上游序列的扩增，在PCR反应管中加入模板DNA，竞争DNA上游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的上游序列；

(5)竞争DNA序列下游序列的扩展，在PCR反应管中加入模板DNA、竞争DNA序列下游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的下游序列；

(6)竞争DNA的获得，分别回收纯化竞争DNA序列的上游序列和下游序列，混合后稀释，取5μl作为模板加入到PCR反应管中，然后依次加入上游序列的上游引物和下游序列的下游引物，dNTPs，Taq Plus扩增酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA，稀释后，通过分光光度计测定竞争DNA的浓度C；

(7)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，BstDNA聚合酶，竞争DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前F_b和反应后的荧光强度F_e，计算F_C，F_C＝F_e/F_b；

(8)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，Bst DNA聚合酶，目标DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前F_b和反应后的荧光强度F_e，计算F_T，F_T＝F_e/F_b；

(9)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，BstDNA聚合酶，浓度为X的模板DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前F_b和反应后的荧光强度F_e；

(10)根据以下公式计算模板DNA的浓度

F_e/F_b＝F_T[X/(X+C)]+F_C[C/(X+C)]＝[C(F_C-F_T)/(X+C)]+F_T。

2、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于所述的进行反应为95～100℃预变性10～15min；94～100℃变性30～35s，50～60℃退火30～35s，72～75℃延伸30～35s，进行30个循环；最后于72～75℃延伸5～10min。

3、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述交替结合淬灭探针的3’末端由氟硼荧光染料进行标记，5’末端为磷酸化处理。

4、根据权利要求3所述的快速检测方法，其特征在于所述的荧光为氟硼荧光染料。

5、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于所述的Bst DNA聚合酶的浓度为8000U/ml，dNTPs浓度为10mmol/L，Taq Plus扩增酶浓度为5000U/ml，rTaq酶浓度为5000U/ml；所述的磷酸缓冲液冲洗细胞的次数为2～3次；步骤(1)中所述的每1L样品预处理液含有1mol盐酸、0.5molpH为8.0的Tris-盐酸和20ml曲拉通100。

6、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于步骤(7)、(8)、(9)中所述的环介导等温扩增引物混合物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物、下游内引物。