[发明专利]抑制乙型肝炎病毒复制的CpG甲基化寡聚脱氧核苷酸

说明书

技术领域

本发明涉及2条可以提高HBV cccDNA甲基化程度并可抑制HBV cccDNA复制的CpG甲基化的寡聚脱氧核苷酸，具体而言，是一种可用于抑制细胞内乙型肝炎病毒复制的CpG甲基化的寡聚脱氧核苷酸。

技术背景

我国是乙型肝炎高发区，约有3000多万乙型肝炎患者，寻找有效抗HBV感染的新方法是亟待解决的重大问题。

乙型肝炎病毒(HBV)感染宿主细胞后，病毒松弛环状DNA(rcDNA)进入细胞核，在宿主酶的作用下，形成共价闭合环状DNA(cccDNA)。cccDNA在肝细胞核内与组蛋白等生物分子结合形成病毒微染色体，它是乙型肝炎病毒基因转录与复制的模板。因此，抑制HBV cccDNA的形成及其转录活性是治疗慢性乙型肝炎的关键，然而目前尚没有能进入细胞核干扰cccDNA的形成并抑制其转录的药物。

目前研究发现，HBV cccDNA序列中存在CpG岛，而且CpG甲基化可以抑制HBV cccDNA的转录与复制。在HBV cccDNA序列中共发现3个CpG岛(见图1)，其中的CpG岛2(1178nt-1349nt)处于HBV基因转录调控元件“密集”区，与增强子I下游/X启动子重叠，我们以及国外的研究均证明CpG岛2甲基化可抑制增强子I/X启动子的活性，抑制X基因以及C、S等基因转录，从而抑制HBV cccDNA的基因转录与复制。因此，CpG岛2可以成为抗病毒治疗的靶点，通过特异甲基化该CpG岛，可以达到抑制病毒复制的目的，但是，目前还没有可以特异诱导HBV cccDNA CpG岛甲基化的方法。

研究证明DNA CpG岛甲基化是可遗传的，即随着双链DNA半保留复制，单链模板DNA的甲基化可以被复制到新合成的子代DNA上。这个过程主要是由DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferases1，DNMT1)完成的。DNMT1的主要作用是维持基因组DNA的甲基化，它是哺乳动物中唯一对半甲基化的位点有强偏好性的DNA甲基转移酶，当它与半甲基化的双链DNA CpG位点结合后，可催化互补链上未甲基化的CpG的胞嘧啶甲基化。因此，在双链DNA中，如果一条链上的CpG的胞嘧啶发生甲基化，在DNMT1酶的作用下，互补链上的CpG胞嘧啶也会被甲基化。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以提高HBV cccDNA互补序列的甲基化程度，抑制乙型肝炎病毒复制的CpG甲基化的寡聚脱氧核苷酸。

为解决上述的技术问题，本发明采取的技术方案：

抑制肝细胞内乙型肝炎病毒复制的CpG甲基化寡聚脱氧核苷酸，其特殊在于：以HBV cccDNA序列中CpG岛2为靶点，设计并合成序列长度在15个～30个碱基，可以抑制乙型肝炎病毒基因复制的CpG甲基化的寡聚脱氧核苷酸。

上述的抑制肝细胞内乙型肝炎病毒复制的CpG甲基化寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：从HBV cccDNA序列中CpG岛2区域中选择含两个以上CpG的正链序列或接近HBV X基因起始码的含CpG的正链序列做为寡聚脱氧核苷酸序列，体外人工合成所选寡聚脱氧核苷酸链并使其中的CpG胞嘧啶甲基化，即制成CpG甲基化的寡聚脱氧核苷酸。

上述的抑制肝细胞内乙型肝炎病毒复制的CpG甲基化寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：以HBV GenBank：U95551.1毒株的DNA CpG岛2序列作为靶点，从该区域正链序列中选择两段含CpG的正链序列，并人工合成CpG甲基化的寡聚脱氧核苷酸，其序列为：

MX1：5’catcagm5cgm5cgtgm5cgtggaa 3’        (1227-1245nt)

MX2：5’gtcctctccm5cgcaaatatacatm5cgt 3’    (1347-1371nt)

其中m5CG表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶甲基化。MX1含3个甲基化CpG；MX2的3’端靠近HBV X基因起始码。

上述的抑制肝细胞内乙型肝炎病毒复制的CpG甲基化寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：以HBV A基因型毒株的DNA CpG岛2序列作为靶点，从该区域正链序列中选择两段含CpG的正链序列，并人工合成CpG甲基化的寡聚脱氧核苷酸，其序列为：

MX1：5’catcagm5cgcatgm5cgtggaa3’              (1225-1243nt)

MX2：5’gtcctctm5cgm5cggaaatatacatm5cgt3’      (1345-1369nt)