[发明专利]一种卡拉八糖的制备方法及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及生物化学、微生物和酶工程领域，具体涉及利用卡拉胶降解酶生产聚合度为3-6的卡拉胶寡糖的方法，尤其涉及利用卡拉胶酶生产聚合度为4的卡拉八糖的方法，该方法制备的卡拉八糖具有具有抑制肿瘤血管生成、抗血栓、抗衰老和治疗糖尿病的作用。

技术背景：

卡拉胶是一种来源于海洋红藻的以1，3-β-D半乳糖和1，4-α-D半乳糖交替连接形成骨架的硫酸半乳聚糖，由于卡拉胶带有大量的硫酸根，表现出很多生理活性，例如抗病毒作用、抗溃疡、抗凝和抗血栓作用等。但是由于卡拉胶属于高分子化合物，粘度大，扩散困难，很难吸收，且有一定的毒性，因此严重限制了卡拉胶在生物医药领域的应用。因而通过制备卡拉寡糖，降低分子量，提高产品的稳定性和安全性，增强其生物活性和溶解性，可作为开发海洋功能食品、海洋新药的重要资源，增加产品的技术含量和附加值，对促进海藻化学工业的蓬勃发展、海洋经济发展、提高海洋生物产业技术水平具有重要意义。

但目前卡拉胶的降解有化学法和酶法两种，其中化学法降解产物不均一，工艺难以控制，因此难以产业化；酶法降解虽然专一性较强，反应条件温和，工艺易于控制，产业化前景好，但是目前酶解产物多是聚合度较低的卡拉二糖和卡拉四糖，而且由于酶活性较低，产物得率低。

发明内容：

本发明的目的是提出一种降解专一性较强、反应条件温和、工艺易于控制、产业化前景好，产物得率高的一种卡拉八糖的酶法制备方法。

本发明的原理是：利用卡拉胶降解酶为工具，该酶可专一性作用于卡拉胶的1，α-3，β糖苷键，降解卡拉胶获得产物均一的卡拉寡糖，主要为卡拉八糖，分离后得到卡拉八糖纯品。

本发明的技术方案是：一种卡拉八糖，其分子结构式如下：

其中n代表卡拉胶寡糖的聚合度，n＝4，分子量为1642。

上述卡拉八糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)培养微生物N5224小时，5000转离心去掉微生物，收集上清，作为粗酶液使用；

(2)将粗酶按照粗酶∶蒸馏水＝1∶10～50的体积比稀释，调pH为6.0-7.0，制备酶解工作液；

(3)按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉胶的比例向酶解工作液中加入卡拉胶，然后在35℃下进行酶解，酶解效果与酶解时间相关，时间越长酶解效果越好，酶解半小时后体系中就出现卡拉八糖的产物，酶解24小时后，卡拉胶完全被降解为卡拉八糖。酶解过程中可以通过控制酶解时间获得不同分子量的产物；

(4)酶解完成后，用95％的乙醇沉淀，收集沉淀物，沉淀物中95％以上的产物是卡拉八糖；或者70℃减压浓缩后，将浓缩液冷冻，然后冷冻干燥，收集粗品，粗品中95％以上的产物是卡拉八糖；

(5)对步骤(4)收集的沉淀物或粗品进行分离纯化，获得卡拉八糖纯品。

本发明制备的卡拉八糖具有抑制肿瘤血管生成、抗菌、抗氧化和降血糖的作用。

本发明的有益效果是：卡拉胶降解酶活性较高，专一作用于卡拉胶的1，α-3，β糖苷键，生成产物均一，制备方法简单易行、可产业化；该制备方法获得的卡拉八糖具有非常广阔的医药领域应用前景。

附图说明

图1是卡拉胶降解酶降解卡拉胶的情况示意图；

图中：A、B、C、D、E分别代表卡拉胶酶作用于卡拉胶24、12、6、3、0.5小时的薄层结果，1代表卡拉八糖的薄层结果。

图2是卡拉八糖抑制肿瘤细胞培养液诱导血管内皮细胞迁移的结果。

图中：A：没有肿瘤细胞培养液诱导；B：存在肿瘤细胞培养液的诱导作用；C：卡拉八糖抑制肿瘤细胞培养液的诱导作用。

图3是卡拉八糖抑制肿瘤血管生成的结果。

图中：A：阴性对照；B：阴性对照小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片，箭头所示为毛细血管；C：经卡拉胶八糖(200mg/Kg)干预后，小鼠肿瘤表面情况；D：经卡拉胶八糖干预后(200mg/Kg)，小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片。

图4是卡拉八糖对小鼠SOD活性的影响。

图5是卡拉八糖对小鼠血液MDA含量的影响。

图6是卡拉八糖对小鼠血液中GSH-Px活性的影响。

图7是卡拉八糖对小鼠血糖浓度的影响。

具体实施方式

实施例1

卡拉八糖的制备：