[发明专利]一种检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒和核苷酸序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒和核苷酸序列，更具体地说，是一种三重实时荧光RT-PCR检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒及其引物与探针，属于检验检疫领域。

背景技术

鱼传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)，鱼病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)和鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus，SVCV)是同属弹状病毒科(Rhabdoviridae)的三种鱼类病毒，也是影响水产养殖业的三种重要病毒。其中，IHNV和VHSV属于粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)，SVCV属于水泡病毒属(Vesiculovirus)，它们均是单链负股RNA病毒。这三种病毒广泛分布于欧洲、美洲和亚洲的许多地区，可感染多种鱼类，尤其是对鱼苗和幼鱼，能引起较高的死亡率，严重时均可达到90％以上。分别由这三种病毒引起的鱼传染性造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis，IHN)，鱼病毒性出血性败血症(Viral hemorrhagicsepticemia，VHS)和鲤春病毒血症(Spring Viraemia of Carp，SVC)一旦爆发，将会给水产养殖业带来灾难性的损失，所以它们是世界各国积极进行防制的三种鱼类疫病。

目前，常用的病毒检测方法是细胞培养分离病毒法、血清学方法以及聚合酶链反应(PCR)。细胞培养分离病毒法结果可靠，但检测周期长，不适用于快速鉴别诊断，而且往往还需要其他方法进行后继检测，才能确定病毒种类。普通PCR技术的应用，提高了检测的特异性和灵敏度，缩短了检测时间，取得了一定的效果。Williams等(1999年)还报到了使用多重RT-PCR检测IPNV、IHNV和VHSV的研究，大大提高了多种病毒检测时的工作效率。但是普通PCR方法检测病毒，需要后继的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，尤其是在检测几种病毒的时候，工作量仍然较大。

Zongxiao Liu等(Zongxiao Liu，Yong Teng，Hong Li，et al.Simultaneous detection ofthree fish rhabdoviruses using multiplex real-time quantitative RT-PCR assay.J VirolMethod，2008，149(1)：103-109.)(Zongxiao Liu，Yong Teng，Hong Li等人，多重实时荧光定量RT-PCR方法检测三种鱼类弹状病毒的研究。J Virol Method，2008，149(1)：103-109。)报道了以Taqman探针为基础的多重实时荧光RT-PCR同时检测IHNV、VHSV和SVCV的方法，他们混合三种不同浓度的病毒RNA作为模板，进行了干扰性实验，此实验并不能够完全排除探针之间的相互干扰，而且由于操作中可能存在的误差，也不能够保证相同模板量得到完全相同的Ct值，故而以此判断模板浓度对效率的影响也是不准确的。Zongxiao Liu等将其设计的多重实时荧光RT-PCR方法应用于临床检测样本分析，效果较好，但其文章中关于对病料的检测，并没有提到检测同时存在几种病毒的情况，因而也就不能够完全说明该方法在实际应用中对几种病毒同时检测的可行性及效果问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组作为引物或探针使用的、检测三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组检验三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列，为序列表SEQ ID No.1至序列表SEQID No.9所示的寡核苷酸序列；其中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为检验传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)的引物对，SEQ ID No.3为检验传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)的探针序列；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为检验病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的引物对，SEQ ID No.6为检验病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的探针序列；SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为检验鲤春病毒血症病毒(SVCV)的引物对，SEQ ID No.9为检验鲤春病毒血症病毒(SVCV)的探针序列。详见表1。