[发明专利]一种检测稻瘟病菌致病相关基因在侵染的水稻叶片组织中表达量的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种检测稻瘟病菌致病相关基因在侵染水稻叶片组织中表达量的方法，属于植物保护领域。

背景技术：

人们在研究基因表达时常采用RT-PCR、Northern原位杂交技术和基因微阵列(基因芯片)技术。RT-PCR只能定性而不能定量的检测基因基因的表达情况。Y.Takano采用了Northern原位杂交技术研究稻瘟病菌侵染水稻过程中其基因表达的情况。但是这种方法适于少量基因的表达研究，并且至少需要5-10μg的总RNA。只能从RNA图像的灰度粗略估计基因上调或下调的倍数，灵敏度和精确度都不高，而且在病害发生初期不能对寄主中病原菌表达量小的基因进行定量检测。Y.Takano和C.Y.Kim采用了基因芯片技术研究基因的表达。与Northern原位杂交技术相比，这种技术适用于大量基因的表达研究，灵敏度也较高，但存在有假阳性结果，有效性不够，还需实时荧光定量PCR或Northern原位杂交验证，也不能进行基因表达差异的准确定量。

由Magnaporthe grisea引起的稻瘟病是世界性分布、危害最重的病害之一。稻瘟病菌致病性和水稻对稻瘟病菌的抗性是一个十分复杂的互作过程。从稻瘟病菌孢子萌发、附着胞形成、侵入、定植以及在水稻细胞间扩展，到产孢后再侵染的每个步骤都有大量基因参与，而且各个基因在不同时间点的表达情况也各不相同。要明确效应蛋白(包括致病蛋白和无毒蛋白)在致病过程中的作用，精确了解致病相关基因在致病过程中表达的时间和表达量的变化。就需要一种具有高度灵敏性、特异性和高精度性的检测技术对其进行检测。并且，目前尚未见利用实时荧光定量PCR检测稻瘟病菌侵染水稻初期其基因表达情况方面的报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有方法的不足，提供了一种定量检测稻瘟病菌致病相关基因在水稻叶片组织中表达的PCR检测方法，能够快速、准确、定量地检测出稻瘟病菌在水稻中侵染的情况，以及其致病相关基因在侵染过程中不同时间点的表达情况。

本方法的技术方案为：

(1)液体培养稻瘟病菌并提取其菌丝体的总RNA，并将其中的mRNA反转录成cDNA；

(2)将稻瘟病菌的孢子接种到水稻植株叶片上，并在接种后早期的不同时间段24h、48h、72h、96h和168h提取侵染组织的总RNA并将其中的mRNA反转录成cDNA；

(3)选择稻瘟病菌MG03982.5肌动蛋白actin基因作为内参基因，并根据该基因和稻瘟病菌致病相关基因：MGS0274.1、MGS0338.1和MGS1460.1的cDNA序列，按照实时荧光定量PCR引物原则设计特异性引物，引物如下：